張偉德，李光學(xué)，馬 銳，劉清蒙

(1.貴州航天醫(yī)院肝膽外科,貴州遵義 563000;2 貴州航天醫(yī)院普外科,貴州遵義 563000;3.遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,貴州遵義 563003;4.遵義醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室,貴州遵義 563003)

·經(jīng)驗(yàn)交流·

肝癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg與IL-2 IL-10 TGF-β表達(dá)的動(dòng)態(tài)觀察及臨床意義

張偉德1，李光學(xué)2，馬 銳3，劉清蒙4

(1.貴州航天醫(yī)院肝膽外科,貴州遵義 563000;2 貴州航天醫(yī)院普外科,貴州遵義 563000;3.遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,貴州遵義 563003;4.遵義醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室,貴州遵義 563003)

目的 了解CD4+CD25+FOXP3+Treg、IL-2、IL-10和TGF-β在肝癌患者外周血中的表達(dá)并探討其臨床意義。方法應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定32例原發(fā)性肝癌(HCC組)和17例繼發(fā)性肝癌(SHC組)患者治療前、治療后1、3、6個(gè)月外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比，用ELISA法測(cè)定IL-2、IL-10和TGF-β的水平，并與18例對(duì)照者進(jìn)行比較。結(jié)果HCC和SHC患者治療前和治療后外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例、IL-10和TGF-β水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；IL-2顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；治療后各時(shí)間點(diǎn)(治療后1、3、6個(gè)月)CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、IL-2、IL-10和TGF-β差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CD4+CD25+FOXP3+Treg、IL-10和TGF-β在肝癌患者外周血中表達(dá)水平明顯升高，IL-2明顯降低。檢測(cè)它們的表達(dá)水平對(duì)肝癌的輔助診斷及治療具有重要臨床意義。

肝腫瘤；Foxp3；白細(xì)胞介素2；白細(xì)胞介素10；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β

調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)是一類可以調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞功能的T細(xì)胞亞型，其在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、預(yù)防自身免疫性疾病、控制移植物排斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。Treg的數(shù)量和功能失調(diào)與多種重大疾病的發(fā)生發(fā)展和結(jié)局密切相關(guān)。研究表明，體內(nèi)Treg特別是CD4+CD25+Foxp3+Treg水平，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展與結(jié)局有密切關(guān)系[1-3]。白細(xì)胞介素2(interleukin-2,IL-2)能刺激已被特異性抗原或致絲裂原啟動(dòng)的T細(xì)胞增殖，使其殺傷活性增強(qiáng)，進(jìn)而清除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞[4]。IL-10是由腫瘤細(xì)胞分泌的能使其逃避免疫監(jiān)視的一種免疫抑制因子[5]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)對(duì)免疫活性細(xì)胞增殖、淋巴細(xì)胞分化、細(xì)胞因子產(chǎn)生具有抑制作用、其可誘導(dǎo)某些原癌基因表達(dá)和具有雙向免疫調(diào)節(jié)功能[6-8]。因此，了解腫瘤患者體內(nèi)Treg及IL-2、IL-10和TGF-β的水平，對(duì)腫瘤的預(yù)防、診斷和治療都會(huì)產(chǎn)生積極的作用。本文動(dòng)態(tài)測(cè)定了原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)及繼發(fā)性肝癌(secondary hepatocarcinoma,SHC)患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg、IL-2、IL-10和TGF-β的水平，探討其與肝癌的可能臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 32例HCC患者，男20例,女12例,年齡38～66歲；17例SHC，男11例,女6例,年齡34～61歲。所有患者經(jīng)病理確診，由貴州航天醫(yī)院、遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院和遵義市醫(yī)院收治。18名健康志愿者作為對(duì)照組,男12名,女6名,年齡36～56歲。均無(wú)任何急、慢性疾病史，亦無(wú)自身免疫性疾病病史或家族史。所有參試者試驗(yàn)前均未行任何放療或化療，3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)任何免疫抑制劑。

1.2 主要試劑和儀器 抗CD4-藻紅蛋白(CD4-PE)、抗CD25-異硫氰酸熒光素(CD25-FITC)和抗FOXP3-AOC均為BD公司產(chǎn)品，紅細(xì)胞裂解液為Solarbio公司產(chǎn)品；Coulter EpicsXL 流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman-Coulter公司)；溶血儀(美國(guó)Beckman-Coulter公司)。

1.3 方法

1.3.1 CD4+CD25+FOXP3+Treg的檢測(cè) 試驗(yàn)對(duì)象均于清晨空腹抽取靜脈血2 mL加肝素抗凝后，靜置6 h后送檢。CD4+CD25+和CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞染色，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)規(guī)定操作，主要流程為：取肝素抗凝靜脈血1 mL,加入紅細(xì)胞裂解液混勻，4 ℃靜置15 min，其間混勻2次，離心，收集細(xì)胞，以PBS洗滌后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×104，加入抗CD4-FITC和抗CD25-PE單克隆抗體各10 μL，室溫暗室孵育20 min，以PBS洗滌，加入抗Foxp3-AOC單克隆抗體10 μL,室溫暗室孵育2 h 30 min，PBS洗滌，細(xì)胞重懸后經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定，數(shù)據(jù)經(jīng)Cell Quest軟件獲取和分析。

1.3.2 IL-2、IL-10和TGF-β的檢測(cè) 所有樣本均于早晨空腹采集靜脈血2 mL，分離血清，-80 ℃保存待測(cè)。IL-2、IL-10 及TGF-β均采用ELISA 雙抗夾心法酶標(biāo)儀測(cè)定，試劑盒由上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司提供，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)規(guī)定操作。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌患者CD4+CD25+FOXP3+Treg及IL-2、IL-10和TGF-β水平 由表1可見(jiàn)治療前HCC組與SHC組患者外周血T細(xì)胞亞群CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+T細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而HCC組和SHC組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。HCC組與SHC組IL-2、IL-10和TGF-β水平組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 治療前、后HCC患者CD4+CD25+FOXP3+Treg及IL-2、IL-10和TGF-β水平 HCC組治療前與治療后比較，患者CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+T細(xì)胞比例無(wú)顯著差異，但與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；IL-2水平，治療后各組均顯著高于治療前(P<0.01)，但治療前與治療后各組均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；IL-10和TGF-β水平，治療前均顯著高于治療后各組(P<0.01)，但治療前和治療后各組仍然明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，治療后各時(shí)間點(diǎn)(治療后1、3、6個(gè)月)均無(wú)明顯差異，見(jiàn)表2。

2.3 治療前、后SHC患者CD4+CD25+FOXP3+Treg及IL-2、IL-10和TGF-β水平 SHC組治療前與治療后各組比較，CD4+CD25+FoXP3+Treg占CD4+T細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。IL-2水平，治療后顯著高于治療前(P<0.05),但治療前、治療后均顯著低于對(duì)照組(均P<0.01)。IL-10和TGF-β水平，患者治療前均顯著低于治療后各組(P<0.01)，治療前和治療后各組均高于對(duì)照組(P<0.01)，但治療后各時(shí)間點(diǎn)(治療后1、3、6個(gè)月)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表1 肝癌患者與對(duì)照組外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg(%)及IL-2、IL-10和TGF-β水平

Treg:CD4+CD25+FOXP3+Treg。

表2 治療后HCC患者與對(duì)照組外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg及IL-2、IL-10和TGF-β水平

Treg:CD4+CD25+FOXP3+Treg。

表3 治療后SHC患者與對(duì)照組外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg及IL-2、IL-10和TGF-β水平

Treg:CD4+CD25+FOXP3+Treg。

A：HCC；B：SHC。

圖1 HCC、SHC患者CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖

3 討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展及結(jié)局與機(jī)體的免疫功能正常與否密切相關(guān)，腫瘤的發(fā)生是惡變細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的結(jié)果。Treg可經(jīng)細(xì)胞接觸依賴或抑制性細(xì)胞因子依賴機(jī)制主動(dòng)抑制自身免疫性T 細(xì)胞的活化，維持自身免疫耐受，防止自身免疫病的發(fā)生?，F(xiàn)認(rèn)為FOXP3是自然Treg分化的重要分子，是Treg的特異性標(biāo)志。FOXP3+Treg的增加可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，抑制機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答[9]。IL-2作為一種重要的免疫增強(qiáng)因子，其可提高機(jī)體的抗腫瘤免疫功能，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[4]。IL-10具有多向生物學(xué)活性，其能抑制抗原遞呈細(xì)胞提呈腫瘤相關(guān)抗原，從而抑制T細(xì)胞對(duì)惡性細(xì)胞產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，有助腫瘤的免疫逃逸。Tang 等[10]認(rèn)為T(mén)GF-β信號(hào)的改變誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞轉(zhuǎn)變成HCC，且腫瘤源性TGF-β通過(guò)抑制免疫監(jiān)視或刺激血管生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞選擇性失去了對(duì)TGF-β介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的反應(yīng)而保留其他功能性TGF-β信號(hào)通路從而表現(xiàn)出其促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的特性[8]。故檢測(cè)CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+T 細(xì)胞的比例可了解體內(nèi)具有調(diào)節(jié)活性的Treg的數(shù)量，檢測(cè)IL-2、IL-10和TGF-β可了解機(jī)體免疫功能狀態(tài)，特別是對(duì)腫瘤患者，具有重要的理論和臨床意義。

本研究結(jié)果顯示原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例，治療前與治療后均明顯高于對(duì)照組，治療后1、3、6個(gè)月結(jié)果無(wú)明顯差異。IL-2治療前顯著低于對(duì)照組，治療后雖有所升高，但仍低于對(duì)照組。IL-10和TGF-β治療前均顯著高于對(duì)照組，治療后雖有明顯下降，但仍然顯著高于正常對(duì)照組。CD4+CD25+FOXP3+Treg、IL-2、IL-10和TGF-β表達(dá)水平，在治療后1、3、6個(gè)月之間結(jié)果無(wú)明顯差異。提示：(1)肝癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg高表達(dá)，應(yīng)是肝癌發(fā)病的原因之一，而不是肝癌發(fā)生的后果。如進(jìn)一步研究規(guī)范檢測(cè)規(guī)程，CD4+CD25+FOXP3+Treg的檢測(cè)或可作為肝癌初篩和輔助診斷指標(biāo)之一;(2)通過(guò)提高內(nèi)源性IL-2的分泌和(或)輸入外源性IL-2，應(yīng)可在一定程度增強(qiáng)肝癌的治療效果;(3)阻斷或降低TGF-β的表達(dá)，干擾或抑制TGF-β對(duì)癌干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，可為肝癌的治療提供新途徑和新靶點(diǎn)。

肝細(xì)胞癌是世界上第五大常見(jiàn)實(shí)質(zhì)性惡性腫瘤和第三大癌癥致死原因。每年超過(guò)60 萬(wàn)人死于該疾病[11]。傳統(tǒng)的化學(xué)治療和放射治療效果不佳，因而患者預(yù)后極差。近年來(lái)的研究證實(shí)，Treg介導(dǎo)的免疫抑制是腫瘤免疫逃逸的一種關(guān)鍵機(jī)制，也是腫瘤免疫治療的主要障礙。如能進(jìn)一步研究腫瘤免疫逃逸的詳細(xì)機(jī)制，采取恰當(dāng)手段，改變和/或減弱，甚至消除機(jī)體對(duì)腫瘤免疫耐受狀態(tài)，同時(shí)維持活化的正常免疫效應(yīng)細(xì)胞，而又不至于誘發(fā)嚴(yán)重的自身免疫應(yīng)答，定會(huì)為肝癌的綜合治療提供新思路新途徑。

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張偉德(1969-),副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.16.039

R735.7

B

1671-8348(2015)16-2264-03

2014-11-08

2015-03-16)