張 燕，王婷婷，徐 曼△，黃文煉，羅 瑋，肖 琳

(1.重慶醫(yī)科大學病理教研室/重慶醫(yī)科大學分子與腫瘤研究中心 400016；2.重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400016)

論著·臨床研究

B7-H4對宮頸癌患者外周血活化T細胞增殖、凋亡和分泌細胞因子的影響*

張 燕1，王婷婷1，徐 曼1△，黃文煉1，羅 瑋2，肖 琳2

(1.重慶醫(yī)科大學病理教研室/重慶醫(yī)科大學分子與腫瘤研究中心 400016；2.重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400016)

目的觀察重組人B7-H4蛋白對宮頸癌患者外周血T細胞增殖周期、凋亡及分泌細胞因子的影響。方法B7-H4分別與15例宮頸癌患者外周血活化淋巴細胞混合培養(yǎng)48 h后，采用流式細胞術分析T細胞增殖、細胞周期、凋亡及各亞群T細胞的變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)芯片檢測培養(yǎng)上清液細胞因子含量。結果宮頸癌患者外周血T細胞與B7-H4混合培養(yǎng)48 h后，G1、G2和S期的T細胞分別占90.59%、8.55%和0.87%，空白對照組T細胞各期占92.83%、6.09%和1.13%；B7-H4組CD4+T和CD8+T細胞的Ki67陽性率分別為2.13%±0.13%和1.03%±1.33%，空白對照組為2.74%±0.98%和1.71%±1.32%。B7-H4組較空白對照組CD8+T和CD4+T細胞占T細胞的比例下降，但CD4+T/CD8+T比值增高，CD4+CD25+Foxp3+T細胞增多；B7-H4組混合培養(yǎng)上清液中TGF-β1含量為(259.25±32.78)pg/mL，空白對照組為(202.75±20.17)pg/mL。B7-H4對宮頸癌患者外周血活化T細胞凋亡無明顯影響。結論B7-H4使宮頸癌患者外周血活化T細胞被阻滯于G2期，S期細胞明顯減少；B7-H4抑制CD4+T和CD8+T細胞增殖，但對Foxp3+T細胞增殖和分泌TGF-β1可能有促進作用;B7-H4對T細胞凋亡無明顯影響。B7-H4在抑制宮頸癌抗腫瘤細胞免疫中發(fā)揮作用，它可能成為宮頸癌免疫治療的潛在靶點。

T細胞周期;宮頸腫瘤；Foxp3+;CD4+;CD8+

宮頸癌患者機體內免疫環(huán)境改變造成腫瘤細胞免疫逃逸是腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因之一，近來研究發(fā)現(xiàn)一些共刺激分子參與了負性調控抗腫瘤免疫反應。B7-H4是共刺激分子B7家族成員之一，它可能與活化T細胞的未知受體結合，調控T細胞的增殖周期和功能[1-3]。B7-H4在人正常組織不表達或偶見表達,但在多種惡性腫瘤高表達。作者前期在回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，人子宮頸癌高表達B7-H4與腫瘤內浸潤的CD8+T細胞數(shù)量減少及分泌干擾素-γ(IFN-γ)下降有關，但與浸潤的CD4+T和Treg細胞數(shù)量無關[4]。為了體外觀察B7-H4對宮頸癌患者T細胞免疫的影響，本研究采用流式細胞術分析了B7-H4對外周血活化T細胞增殖、細胞周期、凋亡以及T細胞亞群的影響，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)芯片檢測了B7-H4對T細胞分泌轉化生長因子-β1(TGF-β1)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 收集15例宮頸癌患者的新鮮抗凝外周血用于體外實驗。液態(tài)人重組B7-H4蛋白(6576-B7)購于美國RD公司；鼠抗人Foxp3(No.12-4771)、CD4-FITC (No.11-0049)、CD8-FITC (No.11-0086)、小鼠IgG1-PE(No.12-4714)和IgG1-FITC(No.11-4714)購自美國eBioscience公司，均是液態(tài)試劑；鼠抗Ki67(液態(tài))購自美國BD公司；人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司；尼龍毛購自德國Kisker公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；小牛血清購自杭州四季青公司；PHA凍干粉購自美國Sigma公司;Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司;ELISA芯片購自Raybiotech公司。

1.2 外周血T細胞分離培養(yǎng) 宮頸癌患者抗凝外周血經(jīng)Ficoll 密度梯度離心后，過尼龍毛柱獲得T細胞并接種于24孔板，每孔T細胞500 μL(1×106/mL)，加入PHA(10 μg/mL)刺激24 h。將T細胞分為兩組，實驗組加入終濃度為2 μg/mL 的重組人B7-H4，空白對照組加入等體積PBS共培養(yǎng)48 h。

1.3 T細胞細胞周期和增殖檢測 收集T細胞經(jīng)70%冰乙醇固定后加入RNA酶和PI染色，4 ℃避光孵育45 min，流式細胞術檢測T細胞周期。T細胞分別與鼠抗人CD4-FITC、鼠抗人CD8-FITC和鼠抗Ki67-PE避光孵育15 min后，流式細胞術檢測CD4+T和CD8+T細胞的Ki67陽性率。

1.4 T細胞凋亡檢測 收集的T細胞經(jīng)Annexin V-PE/7-AAD、鼠抗人CD4-FITC、鼠抗人CD8-FITC和鼠抗人CD3-PE避光孵育15 min后，流式細胞術檢測細胞凋亡和CD4+、CD8+細胞亞群比例。

1.5 分析CD4+CD25+Foxp3+T細胞的比例 T細胞經(jīng)鼠抗人CD4-FITC,鼠抗人CD25-TRITC，鼠抗人Foxp3-PE避光孵育15 min后，流式細胞術檢測T淋巴細胞內CD4+CD25+T細胞及CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例。

1.6 細胞因子含量檢測 ELISA芯片室溫充分復溫后，將B7-H4與T細胞共培養(yǎng)48 h的上清液各200 μL分別加入芯片小孔內，室溫搖床孵育2 h后棄孔內液體并充分清洗。再在各膜中依次加入生物素標記抗體和Cy3-鏈霉親和素孵育2 h并清洗。將檢測液C和檢測液D等量混勻，在膜表面加500 μL檢測混合液，反應完畢后放入芯片檢測儀進行結果分析。

2 結 果

2.1 B7-H4對外周血活化T細胞周期和增殖的影響 B7-H4與宮頸癌患者外周血T細胞混合培養(yǎng)48 h后，G1期、G2期和S期的T細胞分別占90.59%、8.55%和0.87%，而空白對照組分別占92.83%、6.09%和1.13%，B7-H4組的G2期細胞較空白對照組多，而S期細胞明顯少于空白對照組(圖1)。

流式細胞術檢測細胞增殖標志物Ki67結果顯示，B7-H4組宮頸癌患者外周血處于增殖期的CD4+T和CD8+T細胞分別為2.13%±0.13%和1.03%±1.33%，低于空白對照組2.74%±0.98%和1.71%±1.32%(圖2)。

圖1 宮頸癌患者外周血T細胞增殖周期

圖2 CD4+T和CD8+T細胞Ki67陽性率

2.2 B7-H4對外周血CD4+T、CD8+T和Foxp3+T細胞所占比例的影響 B7-H4與宮頸癌患者外周血活化T細胞混合培養(yǎng)48 h后，CD4+T和CD8+T細胞占CD3+T細胞的百分比分別為40.02%±2.70%和17.93%±1.90%；空白對照組則為46.75%±7.30%和25.98%±3.40%。B7-H4組CD4+T細胞和CD8+T細胞占CD3+T細胞百分比均明顯低于空白對照(P<0.05)，見圖3。B7-H4組CD4+T /CD8+T比值為2.23，明顯高于空白對照組的1.79(圖3)。

本研究進一步分析 B7-H4對宮頸癌患者外周血T細胞CD4+CD25+Foxp3+T細胞的影響，結果發(fā)現(xiàn)與B7-H4共培養(yǎng)48 h后，CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD4+T細胞的55.2%±1.95%，而空白對照組CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD4+T細胞的46.4%±4.21%，兩組間存在明顯差異 (P<0.05)，見圖4。

圖3 B7-H4對外周血T細胞亞群的影響

圖4 B7-H4對外周血Foxp3+T細胞亞群的影響

2.3 B7-H4對外周血活化T細胞凋亡的影響 B7-H4蛋白與宮頸癌患者外周血活化混合培養(yǎng)48 h后，T細胞的平均凋亡率為36.2%±1.4%，空白對照組平均凋亡率34.5%±1.5%，兩組間無明顯差異(P>0.05)，見圖5。

圖5 宮頸癌患者外周血T細胞凋亡比例

2.4 B7-H4對T細胞分泌TGF-β1的影響 ELISA芯片檢測結果顯示，B7-H4與活化T細胞共培養(yǎng)48 h后，上清液中TGF-β1含量為(259.25±32.78)pg/mL，空白對照組為(202.75±20.17)pg/mL，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

本研究采用重組人B7-H4與子宮頸癌患者外周血活化T細胞混合培養(yǎng)48 h后，觀察到B7-H4使T細胞周期阻滯于G2期，且S期細胞(DNA合成)明顯減少，該結果與Park等[5]報道B7-H4表達于EBV+淋巴瘤細胞株，可使其細胞周期阻滯相似。本研究進一步檢測CD4+T和CD8+T細胞增殖標記物Ki67的陽性率，發(fā)現(xiàn)B7-H4使活化T細胞中處于增殖狀態(tài)的CD4+T和CD8+T細胞減少，但CD4+T/CD4+T比值高于空白對照組，提示B7-H4抑制CD8+T細胞增殖的作用強于CD4+T細胞。該結果與本課題組前期觀察到子宮頸癌組織內B7-H4高表達與局部浸潤的CD8+T細胞減少有關，與CD4+T細胞數(shù)量無明顯關系相一致。

CD4+T細胞包括輔助T細胞和調節(jié)T細胞亞群，輔助T細胞不僅促進T細胞分化成熟并發(fā)揮細胞免疫功能、也促進B細胞產(chǎn)生抗體[6]；調節(jié)T細胞則通過與靶細胞直接接觸或分泌TGF-β1負性調節(jié)免疫反應，抑制抗腫瘤免疫[7]。文獻報道Treg細胞在腫瘤局部浸潤的淋巴細胞中比例增高，腫瘤患者外周血和局部淋巴結內Treg細胞數(shù)量也增多，且Treg細胞與腫瘤進展以及腫瘤治療效果不佳有關[8-9]。因轉錄因子叉狀頭Foxp3是調節(jié)性T細胞最具特征性的標志物，本研究用Foxp3標記Treg細胞，發(fā)現(xiàn)B7-H4與宮頸癌患者外周血活化T細胞共培養(yǎng)48 h后，CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例明顯高于空白對照組，提示B7-H4可能對Foxp3+Treg細胞的增殖有促進作用，但該作用有待進一步實驗證實。鄧敏端[10]也發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌組織中Foxp3表達明顯比正常宮頸上皮組織和CIN高；Zeng等[11]報道Foxp3+Treg細胞在宮頸癌細胞的發(fā)生和發(fā)展過程中起到重要作用；Tuve等[12]觀察到宮頸癌患者外周血Treg/CD8+T細胞比值增高，小鼠的子宮頸癌模型也存在該現(xiàn)象。僅去除小鼠體內的Treg細胞不能抑制腫瘤生長，如果同時在腫瘤局部聯(lián)合抑制細胞毒T細胞相關抗原4則能增強抗腫瘤免疫，抑制腫瘤生長。提示腫瘤局部CD8+T細胞減少和Treg細胞增多與子宮頸癌發(fā)生發(fā)展明顯相關。陳春燕等[13]發(fā)現(xiàn)B7-H4和Foxp3在乳腺癌均高表達，并且與腫瘤臨床分級和淋巴結轉移相關，而且Treg細胞在腫瘤內浸潤淋巴細胞中所占的比例越高，腫瘤患者的生存率就越低[14-15]，因此作者推測B7-H4抑制CD8+T細胞增殖和免疫功能，可能促進Foxp3+T細胞增殖，從而使宮頸癌局部微環(huán)境的免疫水平低下，有利于癌細胞的免疫逃逸。

TGF-β1在腫瘤進展過程中具有雙向調節(jié)作用，在腫瘤早期通過促進細胞凋亡和阻滯細胞增殖而抑制多種上皮性腫瘤細胞生長；但在腫瘤晚期能下調腫瘤微環(huán)境免疫水平、促進腫瘤血管形成和腫瘤進展。本實驗觀察到在與B7-H4共培養(yǎng)48 h后的T細胞上清液中TGF-β1的含量較空白對照組增高，流式細胞術檢測到Foxp3+T細胞在CD4+T細胞中所占比例增高，提示B7-H4蛋白可能對Treg細胞增殖和分泌TGF-β1均有促進作用，從而使宮頸癌局部的抗腫瘤免疫水平下降，促進宮頸癌進展。由于收集宮頸癌患者外周血Foxp3+T細胞數(shù)量有限，本研究無法進一步觀察B7-H4對Foxp3+T細胞的直接作用。

本研究還觀察到B7-H4組與空白對照組間T細胞的凋亡率無顯著差別,提示B7-H4對外周血活化T細胞凋亡無明顯影響。雖然有研究者觀察到惡性腫瘤細胞表達B7-H4基因影響瘤細胞凋亡，如朱森良等[16]發(fā)現(xiàn)沉默前列腺癌DU145細胞的B7-H4基因后，癌細胞增殖減弱而凋亡細胞增多；Salceda等[17]觀察到敲除乳腺癌細胞的B7-H4基因可導致腫瘤細胞凋亡增多，但兩位作者均觀察到B7-H4表達于瘤細胞影響其增殖和凋亡，與本實驗的研究方法完全不同。

綜上所述，B7-H4抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞增殖，但可能促進Foxp3+Treg細胞增殖，使宮頸癌微環(huán)境T細胞亞群分布發(fā)生改變，同時Foxp3+Treg分泌TGF-β1增多，導致宮頸局部微環(huán)境對癌細胞的免疫監(jiān)視和清除能力下降，在子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。B7-H4有望作為臨床宮頸癌診斷、判斷預后及免疫治療的潛在靶點。

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Influence of B7-H4 on cell proliferation,apoptosis and cytokine secretion of peripheral blood activated T cells in cervical cancer patients*

ZhangYan1,WangTingting1,XuMan1△,HuangWenlian1,LuoWei2,XiaoLin2

(1.DepartmentofPathology,MolecularMedicineandTumorResearchCenterofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2.DepartmentofObstetricsandGynecology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo observe the in vitro influence of recombinant human B7-H4 protein on the cell proliferation cycle,apoptosis and cytokine secretion of peripheral blood activated T lymphocytes in cervical cancer patients.MethodsAfter 48 h co-culture of peripheral blood T lymphocytes in 15 cases of cervical cancer with B7-H4 48 h,T lymphocytes′ cell proliferation cycle,apoptosis and T lymphocytes subtypes changes were detected by FCM；the cytokines concentration in the culture supernatant was tested by ELISA array.ResultsAfter 48 h co-culture of peripheral blood T lymphocytes with B7-H4 48hs,G1,G2 and S phase of T cells accounted for 90.59%,8.55% and 0.87% respectively,which of the blank group were 92.83%,6.09% and 1.13% respectively;the Ki67 positive rates of CD4+T and CD8+T cells in the B7-H4 group were 2.13%±0.13% and 1.03%±1.33% respectively,which of the blank group were 2.74%±0.98% and 1.71%±1.32% respectively;the proportion of CD4+T and CD8+T cells accounting for T cells in the B7-H4 group was decreased compared with the blank group,but the ratio of CD4+T/ CD8+T and the proportion of CD4+CD25+Foxp3+T cells were increased,in addition,the TGF-β1 secretion; concentration in the co-culture supernatant in the B7-H4 group was (259.25±32.78)pg/mL,which was higher than (202.75±20.17)pg/mL in the blank group.B7-H4 had no significant influence on the peripheral blood activated T cells apoptosis.ConclusionB7-H4 block the peripheral blood activated T cells at G2 phase,the S phase cells are obviously decreased;B7-H4 inhibits the cellular proliferation of CD4+T and CD8+cells,but may have the promoting effect on Foxp3+T proliferation and TGF-β1 secretion;B7-H4 has no significant influence on T cell apoptosis.B7-H4 plays a role in depressing anti-tumor T cell immune response of cervical cancer and may become a potential target of cervical cancer immunotherapy.

cell cycle;cervical neoplasm;Foxp3+;CD4+;CD8+

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.26.009

重慶市自然科學基金(CSTC2009BB5268)。

：張燕(1988-)，碩士研究生，主要從事腫瘤與免疫方面的研究?！?/p>

，E-mail:349232467@qq.com。

R711.74

A

1671-8348(2015)26-3628-03

2015-04-08

2015-06-16)