（江西科技師范大學生命科學學院，江西 南昌 330013）

化學發(fā)光酶聯(lián)免疫法檢測蘇丹紅Ⅰ

范 艷，孟 瑋，朱立鑫，劉仁榮*，許 龍，裘雪梅，楊帆帆

（江西科技師范大學生命科學學院，江西 南昌 330013）

為檢測食品中蘇丹紅Ⅰ殘留，建立間接競爭化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA）法。通過優(yōu)化包被抗原中本抗原與載體物質(zhì)的量比、包被抗原質(zhì)量濃度、抗體稀釋比例，建立競爭抑制曲線。線性范圍為0.156～5 ng/mL，最低檢測限為0.078 9 ng/mL，IC50為0.679 ng/mL。CLEIA回收率為75.08%～112.18%，變異系數(shù)為8.89%～15.61%；通過與酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法進行比較，在相同抗原抗體質(zhì)量濃度條件下，CLEIA法測定的IC50較ELISA方法降低30%，具有較高的靈敏度。

蘇丹紅Ⅰ；化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析；酶聯(lián)免疫吸附分析

蘇丹紅染料是一系列化學合成的脂溶性偶氮化合物，在工業(yè)上廣泛應用，如地板、塑料、印刷用油墨等的染色[1]。因為其具有良好的著色性，不法商販將蘇丹紅染料作為食品添加劑加入辣椒、番茄等食品中，進入人體內(nèi)的蘇丹紅經(jīng)各種酶系代謝后，形成的部分代謝產(chǎn)物具有致突變、致癌變的生物活性[2-3]。1995年歐盟國家已經(jīng)禁止將蘇丹紅作為食用色素，2005年英國食品標準署就食品添加蘇丹紅色素發(fā)出警告[4]，國際癌癥研究機構將蘇丹紅歸為三類致癌物。因此需要對食品中含有的蘇丹紅染料進行監(jiān)控[5-6]。

現(xiàn)階段檢測蘇丹紅染料的方法有色譜法、光譜法、免疫檢測方法和電化學方法[7-9]等。色譜法主要包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[10-12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、高效液相色譜-二極管陣列檢測器和電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用等[13-15]。光譜法有紅外光譜快速檢測[16]，這些方法具有應用廣泛、重復性好和檢測結果準確等優(yōu)點，但需要昂貴的設備、復雜的樣品處理過程和較長的檢測時間。免疫學檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法[17-18]、化學發(fā)光酶聯(lián)免疫（chemiluminescentenzyme immunoassay，CLEIA）法[19-22]等。CLEIA法是化學發(fā)光法和免疫分析法結合的產(chǎn)物，同時具備化學發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性[23]。近年來已經(jīng)大規(guī)模應用到食品有毒有害殘留分析。

本實驗基于魯米諾-辣根過氧化物酶系統(tǒng)，對實驗因素進行了探索和優(yōu)化，建立了檢測蘇丹紅Ⅰ（SudanⅠ）的間接競爭CLEIA方法。該方法操作簡便、靈敏度高、特異性好，能滿足大規(guī)模樣品的快速篩選。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

SudanⅠ標準品、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG美國Sigma公司；抗SudanⅠ單克隆抗體 本實驗室自制；化學發(fā)光魯米諾底物 廈門赫利森公司。

包被液：0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），pH 7.4；封閉液：50 g/L脫脂奶；清洗液：含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；標準品稀釋液：30%甲醇溶液。實驗所用化學試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

Luminoskan Ascent化學發(fā)光儀、Multiskan MK3酶標儀、Wellwash versa洗板機 美國Thermo公司；96孔酶標板與96孔發(fā)光板 美國Costar公司。

1.3方法

1.3.1包被抗原SudanⅠ-BSA的制備

采用活潑酯法進行半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)，稱取羧基化SudanⅠ2 mg[24]，N-羥基琥珀酰亞胺2.31 mg，碳二亞胺3.85 mg，溶于400μL N,N-二甲基甲酰胺后，在21℃，120 r/min反應12 h。稱取30 mg BSA溶于12 mL 0.13 mol/L NaHCO3溶液中。將活性酯溶液按照不同物質(zhì)的量比例緩慢滴入BSA溶液中，17℃，120 r/min反應8 h。取出反應液放入透析袋中，在PBS中透析3 d，偶聯(lián)產(chǎn)物用紫外光譜掃描，根據(jù)其在波長280、490 nm處的吸光度A分析測定偶聯(lián)物的物質(zhì)的量比。

1.3.2間接競爭CLEIA法的建立

用PBS稀釋SudanⅠ-BSA包被在96孔化學發(fā)光板，120μL/孔，4℃包被過夜；用PBST洗板4次后，每孔加入320μL脫脂奶在37℃保溫保濕2 h。洗板4次后，每孔加入50μL合適質(zhì)量濃度的抗體稀釋液和50μL標準品稀釋液，在37℃保溫保濕45 min。洗板4次，加入1∶3 000酶標二抗，37℃保溫保濕45 min。洗板4次，加入化學發(fā)光底物100μL/孔，立即用化學發(fā)光檢測儀檢測各孔化學發(fā)光強度。

1.3.2.1最佳包被抗原質(zhì)量濃度的選擇

用方陣滴定法，選取0.5、1、2、4、8μg/mL質(zhì)量濃度的SudanⅠ-BSA包被96孔板，抗SudanⅠ單克隆抗體按照1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000、1∶1 024 000進行稀釋，按照間接CLEIA法步驟，選取最佳包被質(zhì)量濃度。

1.3.2.2最佳抗體稀釋比例的選擇

按照選取的最佳SudanⅠ-BSA質(zhì)量濃度包被96孔板后，選擇1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000這4種抗體稀釋比例按照間接競爭法，測定對應的化學發(fā)光值（relative lighe unit，RLU）和IC50，以IC50和RLUmax/IC50作為評價標準。RLUmax/IC50最大的選為最佳抗體稀釋比例。

1.3.2.3間接競爭CLEIA法標準曲線的建立

按照確定的最佳抗原包被質(zhì)量濃度，最佳抗體稀釋比例，以標準品SudanⅠ質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標，以I/I0（I為不同標準品質(zhì)量濃度時的RLU；I0為標準品質(zhì)量濃度為0 ng/mL時的RLU）為縱坐標，通過RIDAWIN免疫分析軟件，建立標準曲線。

1.3.3實際樣品的加標回收及與ELISA方法的對比

稱取辣椒粉1 g放入離心管中，分別添加SudanⅠ標準品0、0.1、0.5、1μg/g。每管加入6 mL乙腈，四管辣椒粉旋渦振蕩器劇烈振蕩10 min后，超聲波提取20 min，然后4 500 r/min離心15min。取上清液3 mL，放入玻璃試管中，用N2吹干，每管加入1 mL甲醇溶解，然后加入蒸餾水配制成30%的甲醇溶液，分別用CLEIA和ELISA方法進行檢測（各測4次，取平均值）。

2 結果與分析

2.1 SudanⅠ-BSA人工抗原的制備

通過活潑酯法將SudanⅠ與BSA偶聯(lián)并透析后得到了人工抗原SudanⅠ-BSA，人工抗原的紫外光譜掃描結果見圖1。4條曲線代表4種不同物質(zhì)的量比例偶聯(lián)的SudanⅠ-BSA。BSA標準品的特征吸收峰是280 nm，SudanⅠ的特征吸收峰490 nm，人工抗原在波長280 nm與490 nm處均出現(xiàn)了吸收峰，通過繪制SudanⅠ與BSA的標準曲線，計算得出物質(zhì)的量偶聯(lián)比例。

圖1 4 種偶聯(lián)比的SudanⅠ-BSA紫外掃描圖Fig.1 UV spectra of Sudan Ⅰ-BSA with different conjugation ratios

2.2CLEIA工作條件的確定

2.2.1包被抗原質(zhì)量濃度的確定

根據(jù)方陣滴定結果，在一定的抗體稀釋比例下，2μg/mL SudanⅠ-BSA包被時的發(fā)光強度明顯高于0.5、1μg/mL。4μg/mL與8μg/mL包被時，發(fā)光強度變化逐漸平緩，分別將SudanⅠ-BSA用2、4μg/mL和8μg/mL 3種質(zhì)量濃度進行包被，比較其IC50變化，見圖2，在相同的抗體稀釋比例下，2μg/mL包被時測定的IC50低于4μg/mL與8μg/mL，綜合RLU與IC50選擇2μg/mL作為其最優(yōu)包被質(zhì)量濃度。

圖2 包被質(zhì)量濃度對CLEIA的影響Fig.2 Effect of coating antigen concentration on CLEIA

2.2.2抗體稀釋比例的確定

SudanⅠ-BSA包被質(zhì)量濃度為2μg/mL時，隨著抗體稀釋比例的增大，IC50先明顯降低，后變化平緩。RLU隨抗體稀釋比例的增大而顯著減小。根據(jù)RLUmax/IC50值的變化，在抗體稀釋比例為1∶64 000時RLUmax/IC50達到最大，見圖3。所以選擇抗體最佳稀釋比例為1∶64 000。

圖3 抗體稀釋比例對CCLLEEIIAA的影響Fig.3 Effect of antibody dilution ratio on CLEIA

2.2.3包被抗原SudanⅠ-BSA的半抗原與載體偶聯(lián)比的影響

圖4 SudanⅠ-BSA物質(zhì)的量比對CLEIA與ELISA的影響Fig.4 Effects of molar ratio of SudanⅠ to BSA on CLEIA and ELISA

SudanⅠ-BSA用4種偶聯(lián)比例用活潑酯法合成后，按照2.2.1節(jié)和2.2.2節(jié)的優(yōu)化過程得到抗原包被質(zhì)量濃度和抗體稀釋比例后，4種不同偶聯(lián)比的抗原對CLEIA和ELISA兩種方法測定的IC50影響見圖4。由圖4可知，不同的偶聯(lián)比對CLEIA的IC50影響不大，對ELISA，偶聯(lián)比在0.27∶1和11.8∶1時，IC50都顯著上升，在偶聯(lián)比值為2.05∶1時，IC50最小，證明SudanⅠ與BSA物質(zhì)的量比為2.05∶1時，比較合適。所以包被抗原選擇偶聯(lián)比為2.05∶1的SudanⅠ-BSA。

2.2.4CLEIA和ELISA標準曲線的建立

圖 55 CCLLEEIIAA間接競爭抑制曲線Fig.5 Indirect competitive inhibition curve of CLEIA

圖6 ELISA間接競爭抑制曲線Fig.6 Indirect competitive inhibition curve of ELISA

SudanⅠ-BSA包被質(zhì)量濃度為2μg/mL，抗體稀釋比例為1∶64 000，建立的CLEIA間接競爭曲線見圖5。標準品SudanⅠ質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標，以I/I0為縱坐標。IC50為0.679 ng/mL，線性范圍是0.132～5 ng/mL，線性方程為y=-0.45x+0.403 7，R2=0.989 1；選擇IC10為最低檢測限，最低檢測限是0.078 9 ng/mL。建立的ELISA間接競爭曲線見圖6，IC50為1.0 ng/mL，線性范圍是0.2～5 ng/mL，線性方程為y=-0.443x+0.490，R2=0.998 0；選擇IC10為最低檢測限，最低檢測限為0.118 ng/mL。

2.3樣品的檢測及與ELISA方法的對比

表11 CCLLEEIIAA加標回收率Table 1 Recovery rates of CLEIA for spiked sample

由表1、2可知，CLEIA法測定的加標回收率為75.08%～112.18%，變異系數(shù)為8.89%～15.61%。ELISA法測定的加標回收率為94.59%～150.18%，變異系數(shù)為5.3%～10.9%。建立的CLEIA法能檢測實際樣品。

表2 ELISA加標回收率Table 2 Recovery rates of ELISA for spiked sample

3 結 論

本實驗通過優(yōu)化包被抗原質(zhì)量濃度、包被抗原偶聯(lián)比、抗體稀釋比例，建立了間接競爭CLEIA法檢測辣椒粉中的SudanⅠ的添加量。IC50為0.679 ng/mL，線性范圍為0.132～5 ng/mL，最低檢測限為0.078 9 ng/mL。包被抗原偶聯(lián)比對CLEIA方法的IC50影響較小，CLEIA方法的發(fā)光強度RLU信號放大倍數(shù)優(yōu)于ELISA方法的吸光度，在相同的低偶聯(lián)比抗原包被質(zhì)量濃度條件下，CLEIA方法的IC50較穩(wěn)定。相同抗原抗體質(zhì)量濃度條件下，CLEIA法測定的IC50較ELISA方法降低30%左右，相比ELISA方法，CLEIA方法靈敏度較高，檢測限低于ELISA方法。測定的辣椒粉中SudanⅠ加標回收率為75.08%～112.18%，變異系數(shù)為8.89%～15.61%。與ELISA方法對比，變異系數(shù)稍大，是由于化學發(fā)光方法很靈敏，操作中的各種因素均會對實驗結果造成較大影響，回收率較低，可能是SudanⅠ吸附性較強，在加標回收過程中損失較大。因此實驗操作需要快速和準確，相關實驗條件也需進一步優(yōu)化。綜合比較兩種方法，CLEIA檢測方法具有較好的靈敏度和準確度，符合實際樣品中蘇丹紅大批量檢測的需求，可用于相關食品安全污染物和非法添加物的快速高效的檢測。

[1] BUDDHADASA S C, MISHRA V, MATTA A K, et al. Measurement of Sudan dyesⅠ,Ⅱ, Ⅲ, and Ⅳ residues in chili powder[J]. Food Australia, 2007, 59(9): 439-441.

[2]黃曙海,龐維群.蘇丹紅染料毒性研究及食品中蘇丹紅檢測方法簡述[J].廣西預防醫(yī)學, 2005, 11(6): 380-383.

[3] FONOVICH T M. Sudan dyes: are they dangerous for human health?[J]. Drug and Chemical Toxicology, 2013, 36(3): 343-352.

[4]宋雁.食品中蘇丹紅的危險性評估[J].國外醫(yī)學:衛(wèi)生學分冊, 2005, 32(3): 129-132.

[5] ZHOU Min, CHEN Xiaofeng, XU Yinyin, et al. Sensitive determination of Sudan dyes in foodstuffs by Mn-ZnS quantum dots[J]. Dyes and Pigments, 2013, 99(1): 120-126.

[6] ZHU Yonghong, ZHAO Bo, XIAO Ruiqi, et al. Simultaneous determination of 14 oil-soluble synthetic dyes in chilli products by high performance liquid chromatography with a gel permeation chromatography clean-up procedure[J]. Food Chemistry, 2014, 145(15): 956-962.

[7] ZHANG Jing, WANG Meiling, CHAO Shentu, et al. Electrochemical detection of SudanⅠby using an expanded graphite paste electrode[J]. Journal of Electroanalytical Chemistry, 2012, 685(1): 47-52.

[8] YANG Qinyan, SUN Qian, ZHOU Tianshu, et al. Determination of parathion in vegetables by ele ctrochemical sensor based on molecularly imprinted polyethyleneimine/silica gel films[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(15): 6558-6563.

[9] XIAO Fei, ZHANG Ningdan, GU Hongjie, et al. A monoclonal antibodybased immunosensor for detection of SudanⅠusing electrochemical impedance spectroscopy[J]. Talanta, 2011, 84(1): 204-211.

[10] ATES E, MITTENDORF K, SENYUVA H. LC/MS method using cloud point extraction for the determination of permitted and illegal food colors in liquid, semiliquid, and solid food matrixes: singlelaboratory validation[J]. Journal of AOAC International, 2011, 94(6): 1853-1862.

[11] CHEN D, LI X, TAO Y, et al. Development of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry with ultrasound-assisted extraction method for the simultaneous determination of sudan dyes and their metabolites in the edible tissues and eggs of food-producing animals[J]. Journal of Chromatography Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2013, 939(15): 45-50.

[12] LIU Rongyuan, HEI Wenjing, HE Pingli, et al. Simultaneous determination of fifteen illegal dyes in animal feeds and poultry products by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2011, 879(24): 2416-2422.

[13]黃曉蘭,吳惠勤,黃芳,等. GC-MS/SIM法同時測定食品中的蘇丹紅Ⅰ-Ⅳ[J].分析測試學報, 2005, 24(4): 1-5.

[14] CORNET V, GOVAERT Y, MOENS G, et al. Development of a fast analytical method for the determination of sudan dyes in chili- and curry-containing foodstuffs by high-performance liquid chromatography-photodiode array detection[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(3): 639-644.

[15] SCHUMMER C, SASSEL J, BONENBERGER P, et al. Low-level detections of SudanⅠ,Ⅱ, Ⅲ, and Ⅳ in spices and chili-containing foodstuffs using UPLC-ESI-MS/MS[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(9): 2284-2289.

[16]張瑋瑋,劉玲玲,武彥文.食用天然辣椒紅色素中摻雜蘇丹紅的紅外光譜快速識別[J].光譜學與光譜分析, 2012, 32(4): 958-961.

[17] HAN Dan, YU Meng, KNOPP D, et al. Development of a highly sensitive and specific enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Sudan Ⅰ in food samples[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(16): 6424-6430.

[18]何方洋.蘇丹紅殘留酶聯(lián)免疫檢測技術研究[J].食品研究與開發(fā), 2009, 30(6): 139-143.

[19] VDOVENKO M M, ZUBKOV A V, KUZNETSOVA G I. Development of ultrasensitive soybean peroxidase-based CL-ELISA for determination of human thyroglobulin[J]. Luminescence, 2010, 25(2): 110-111.

[20] SUN J W, ZHANG Y, WANG S. Development of chemiluminescence enzyme-linked immunosorbent assay for the screening of metolcarb and carbaryl in orange juice, cabbage and cucumber[J]. Food Additives and Contaminants, 2010, 27(3): 338-346.

[21] ZHANG Suxia, ZHANG Zhen, SHI Weimin, et al. Development of a chemiluminescent ELISA for determining chloramphenicol in chicken muscle[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(16): 5718-5722.

[22]徐曉嬰,盧慶鋆,徐艷力,等.化學發(fā)光酶免疫法檢測鹽酸克倫特羅殘留[J].上海交通大學學報, 2009, 27(2): 126-128.

[23]趙麗霞,李振甲,魏彥林,等.化學發(fā)光免疫分析[J].世界科技研究與發(fā)展, 2004, 26(4): 24-33.

[24]孟瑋,劉仁榮,裘雪梅,等.蘇丹紅Ⅰ結構類似物合成及其人工抗原的制備研究[J].食品科學, 2009, 30(20): 169-172.

Determination of Sudan Ⅰ by Chemiluminescent Enzyme Immunoassay

FAN Yan, MENG Wei, ZHU Lixin, LIU Renrong*, XU Long, QIU Xuemei, YANG Fanfan
(College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China)

An indirect competitive chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) was developed for the detection of Sudan Ⅰ in food products. TheCLEIAconditions including molar ratio of coating antigen to carrier, antigen concentration, and dilution ratio of antibody were optimized. In the standard curve of the optimizedCLEIA, the linear range was 0.1 56-5 ng/mL, the half maximal inhibitory concentration (IC50) was 0.679 ng/mL and the limit of detection (LOD) was 0.078 9 ng/mL. TheCLEIAshowed good recoveries with spiked chili powder ranging from 75.08%to 112.18%. Compared with ELISA method, the IC50values ofCLEIAwas reduced by 30%. The proposed method has a high sensitivity.

Sudan Ⅰ; chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA); enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

TQ610.7；O657.3

A

1002-6630（2015）12-0209-04

10.7506/spkx1002-6630-201512039

2014-08-03

江西省自然科學基金項目（20122BAB214006）；江西省教育廳科技項目（GJJ13573）

范艷（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全檢測。E-mail：fy12271227@163.com

*通信作者：劉仁榮（1969—），男，教授，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：lilirenrong@hotmail.com