羅 燕，羅明燕

(江西省婦幼保健院生殖健康科，南昌 330006)

子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)慢性盆腔痛患者子宮在位內(nèi)膜PGP 9.5表達的臨床意義

羅 燕，羅明燕

(江西省婦幼保健院生殖健康科，南昌 330006)

目的研究蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gene product 9.5，PGP 9.5)在子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)患者在位內(nèi)膜功能層的表達及其與慢性盆腔痛(chronic pelvic pain，CPP)的關(guān)系，探討神經(jīng)纖維(PGP 95的表達)在EMs相關(guān)CPP中的作用以及GnRHa藥物對其治療效果。方法對40例行手術(shù)治療的EMs患者(EMs組)和40例同期手術(shù)的育齡期婦女(對照組)采用免疫組織化學(xué)SP法，檢測子宮在位內(nèi)膜功能層中PGP 9.5的表達。通過視覺模擬評分法(VAS)對EMs患者進行CPP程度及手術(shù)分期(rAFS)評定，并采用Spearman法分析兩者與PGP 9.5的相關(guān)性。對EMs患者促性腺激素釋放激素激動劑(GnRHa)治療前后在位內(nèi)膜PGP 9.5表達情況進行比較。結(jié)果EMs組子宮在位內(nèi)膜功能層的PGP 9.5表達為10.48±4.44，對照組未見PGP 9.5表達(P<0.01)。Spearman相關(guān)性分析：EMs患者子宮在位內(nèi)膜功能層PGP 9.5表達與CPP的VAS評分呈正相關(guān)(r=0.833，P<0.01)，與rAFS無相關(guān)性(r=-0.094，P>0.05)。EMs患者術(shù)后使用GnRHa治療后PGP 9.5表達及VAS評分顯著低于治療前(P<0.01)。結(jié)論EMs CPP患者在位內(nèi)膜功能層中PGP 9.5的特異性表達，可能為EMs早期診斷提供新的生物標識物；EMs子宮在位內(nèi)膜功能層PGP 9.5的高表達與CPP呈正相關(guān)，與rAFS無相關(guān)。GnRHa類藥物緩解EMs CPP的原因之一是減少了EMs在位內(nèi)膜中神經(jīng)纖維分布密度。

子宮內(nèi)膜異位癥； 慢性盆腔痛； 在位內(nèi)膜； 蛋白基因產(chǎn)物9.5

慢性盆腔痛(chronic pelvic pain，CPP)是指持續(xù)的非周期性，不明原因的持續(xù)6個月以上，對非阿片類藥物治療無效的盆腔疼痛。有報道，CPP患者在門診就診數(shù)中達2%～10%[1]1466，嚴重影響婦女的生活質(zhì)量。CPP病因復(fù)雜，涉及多個系統(tǒng)，其中約50%的患者腹腔鏡探查原因是由子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)引起[2]，但對于EMs是如何導(dǎo)致CPP的具體機制仍不甚明確。本研究旨在探討蛋白基因產(chǎn)物PGP 9.5(protein gene product 9.5，PGP 9.5)在EMs患者子宮在位內(nèi)膜功能層的表達，及其與CPP程度的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012年6月至2014年6月在江西省婦幼保健院行手術(shù)治療的EMs患者40例(EMs組)，經(jīng)腹腔鏡及病理活檢確診，均為育齡期婦女。年齡19～47(37.08±7.29)歲，月經(jīng)規(guī)律，周期為28～32 d。CPP及手術(shù)疼痛的程度按視覺模擬評分法(visual analogue scale，VAS)評定：輕度19例，中度16例，重度5例。EMs手術(shù)分期(rAFS)按美國生育學(xué)會1996年修訂的標準：Ⅰ期10例，Ⅱ期9例，Ⅲ期15例，Ⅳ期6例。無其他內(nèi)分泌、免疫和代謝性疾病，術(shù)前3個月內(nèi)未接受過激素治療。選擇同期手術(shù)的育齡期婦女40例(對照組)，年齡23～49(36.80±8.08)歲。其中卵巢單純性囊腫或卵巢囊性畸胎瘤25例，子宮肌瘤15例，經(jīng)手術(shù)及病理檢查均排除EMs。全部病例標本取材經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準及患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集、治療方法及隨訪

2組患者術(shù)前行刮宮術(shù)或?qū)m腔鏡下子宮內(nèi)膜活檢獲取子宮在位內(nèi)膜，均為增生期子宮內(nèi)膜。EMs組術(shù)后使用促性腺激素釋放激素激動劑(Gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRHa)治療30例，隨訪3～6個月，再次取患者子宮在位內(nèi)膜組織標本25例；失訪5例。

1.2.2 檢測方法

所有樣本用10%甲醛固定18～24 h，常規(guī)脫水石蠟包埋，切片厚度4 μm，每例石蠟切片3張，1張常規(guī)行HE染色，2張行免疫組織化學(xué)(SP)檢測。試劑采用鼠抗人PGP 9.5單克隆抗體(稀釋濃度：1:100)，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

免疫組織化學(xué)方法：石蠟切片常規(guī)脫蠟浸水，蒸餾水浸泡5 min，PBS沖洗3次；枸櫞酸緩沖液煮沸(沸水浴)修復(fù)15 min，PBS沖洗3次；3%過氧化氫水溶液，室溫孕育20 min，PBS沖洗3次；滴加正常山羊血清工作液，37 ℃ 孵育15 min，去除多余正常山羊血清工作液；滴加一抗鼠抗人PGP 9.5單克隆抗體(1:100)4 ℃過夜；復(fù)溫20 min，PBS沖洗3次；滴加二抗37 ℃ 孵育20 min，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次；滴加三抗(鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液)37 ℃ 孵育20 min，PBS沖洗3次；DAB顯色；蒸餾水充分沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 鏡下觀察及結(jié)果判斷

應(yīng)用同一光學(xué)顯微鏡觀察免疫組織化學(xué)切片棕黃色神經(jīng)纖維的分布情況，用同一圖像采集系統(tǒng)對其進行拍攝，先在低倍鏡下選取神經(jīng)纖維高密度區(qū)，再轉(zhuǎn)換成200倍鏡，計數(shù)拍攝的視野中神經(jīng)纖維的數(shù)目。計數(shù)5個不同視野中神經(jīng)纖維的數(shù)目，取平均值作為該石蠟切片的神經(jīng)纖維密度(即為PGP 9.5的表達)，由2名資深病理科醫(yī)生分別計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組子宮在位內(nèi)膜功能層PGP 9.5的表達

EMs組子宮在位內(nèi)膜功能層的PGP 9.5表達為10.48±4.44，對照組未見PGP 9.5表達(P<0.01)。

2.2 EMs患者子宮在位內(nèi)膜功能層PGP 9.5的表達與CPP的VAS評分、rAFS的相關(guān)性

采用Spearman法進行相關(guān)性分析：EMs患者子宮在位內(nèi)膜功能層PGP 9.5表達與CPP的VAS評分呈顯著相關(guān)性(r=0.833，P<0.01)，且隨著CPP程度的加重，子宮在位子宮內(nèi)膜功能層中PGP 9.5的表達有顯著增高趨勢；PGP 9.5表達與rAFS無相關(guān)性(r=-0.094，P>0.05)。

2.3 EMs患者GnRHa治療前后子宮在位內(nèi)膜功能層PGP 9.5的表達及VAS評分

EMs組術(shù)后使用GnRHa治療30例(失訪5例)，藥物治療后PGP 9.5表達及VAS評分均顯著低于治療前(均P<0.01)。見表1。

治療時間nPGP9.5VAS評分/分GnRHa治療前2511.30±4.26*6.72±1.54*GnRHa治療后256.11±2.772.64±0.86

*P<0.01與GnRHa治療后比較。

3 討論

3.1 子宮內(nèi)膜功能層PGP 9.5的表達

CPP是子宮內(nèi)膜異位癥主要的臨床癥狀，表現(xiàn)為：痛經(jīng)、深部性交痛、排便痛及器官功能異常等[3]，多位于下腹部及腰骶部，可放射至陰道、會陰、肛門及大腿。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，CPP的發(fā)生與神經(jīng)纖維異常增生及神經(jīng)沖動傳導(dǎo)異常相關(guān)，對于神經(jīng)纖維異常增生及神經(jīng)沖動傳導(dǎo)異常的原因尚需進一步的研究。PGP 9.5是常用的神經(jīng)纖維標識物，屬泛素肽羧基末端水解酶類家族，在細胞水解途徑中調(diào)節(jié)細胞進程，包括細胞的分裂周期和死亡。PGP 9.5在神經(jīng)源性腫瘤中被首次發(fā)現(xiàn)，它是普遍存在的竣基末端輕化酶家族成員之一，可特異性地標記神經(jīng)元細胞及神經(jīng)纖維，主要標識有髓和無髓神經(jīng)纖維(c纖維)[5]，是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)一特定的生物標記。因PGP 9.5可標記子宮所有的神經(jīng)分布[6]，因此本研究以PGP 9.5作為子宮內(nèi)膜及EMs子宮在位內(nèi)膜神經(jīng)分布的檢測指標。研究結(jié)果顯示：所有EMs患者子宮在位內(nèi)膜功能層均有PGP 9.5的表達，而對照組(非EMs)的子宮內(nèi)膜功能層無PGP 9.5表達(P<0.05)。所以，EMs患者子宮在位內(nèi)膜功能層分布的神經(jīng)纖維大多數(shù)為感覺神經(jīng)C，即為新生的無髓感覺纖維，這與Tokushige等[7]的研究結(jié)果基本一致,可初步解釋EMs疼痛多為鈍痛的原因。

綜上所述，在患有EMs婦女的子宮在位內(nèi)膜的功能層發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維的分布，而非EMs婦女子宮內(nèi)膜功能層未發(fā)現(xiàn)任何神經(jīng)纖維分布。因此，只有EMs患者的子宮在位內(nèi)膜功能層才能發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維的存在或密度更高的這一結(jié)論不但可以有助于進一步闡述EMs相關(guān)CPP產(chǎn)生的機制，而且可通過子宮內(nèi)膜活檢或診刮術(shù)來檢測子宮內(nèi)膜功能層神經(jīng)纖維密度(檢測PGP 9.5的表達)可成為臨床診斷EMs的一種新型生物分子指標，即新的EMs的生物標識。傳統(tǒng)上，腹腔鏡檢查及術(shù)中組織活檢被認為是EMs診斷的“金標準”，可較全面地觀察病變[8]。但是手術(shù)的風(fēng)險仍然超過潛在的未被證明的益處，而且有研究[4]表明，EMs出現(xiàn)到明確診斷所需的時間為6～7年之久，這大大延誤了早期EMs的診斷和治療。本研究提示，PGP 9.5可能成為早期診斷EMs的生物標記物，可根據(jù)在子宮內(nèi)膜功能層中能否檢測出PGP 9.5表達，結(jié)合臨床表現(xiàn)及其他生物指標，預(yù)測其患EMs的概率，有利于EMs的早期診斷、及時治療。也有研究[9-10]提示，PGP 9.5在子宮腺肌癥中也有特異性表達，為其診斷提供了新的方向及后續(xù)治療提供更大空間。

3.2 EMs患者子宮在位內(nèi)膜PGP 9.5表達與CPP的VAS評分及rAFS的相關(guān)性

本研究發(fā)現(xiàn)，PGP 9.5在EMs患者子宮在位內(nèi)膜功能層的表達與CPP的VAS評分成正相關(guān)(r=0.833，P<0.01)，即PGP 9.5表達越高，疼痛程度越重。而PGP 9.5的表達與rAFS無顯著相關(guān)性(r=-0.094,P>0.05)。rAFS是目前EMs臨床診治中常用的分期方法，但是腹腔鏡手術(shù)中主要依據(jù)卵巢和腹膜的病灶大小、粘連程度進行分期，未考慮疼痛的程度以及深部侵潤病灶的分布，具有主觀隨意性。臨床研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，rAFSⅢ—Ⅳ期EMs患者盆腔病變可能僅表現(xiàn)為體積較大的卵巢囊腫，沒有明顯的疼痛癥狀，而部分有嚴重疼痛癥狀的陰道直腸隔患者EMs分期較早，多伴有明顯的疼痛癥狀。因此EMs的rAFS沒有考慮盆腔外的內(nèi)膜異位病灶，與疼痛以及深部侵潤病灶的分布無關(guān)，對預(yù)測盆腔痛及治療方案參考價值不大[1]1492-1493。所以，本研究進一步證實EMs相關(guān)的CPP程度與rAFS無明顯相關(guān)性。

3.3 GnRHa藥物治療與CPP的關(guān)系

GnRHa其作用機制是與下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)受體結(jié)合并占據(jù)受體結(jié)合位點,繼而減少垂體的黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)分泌，使卵巢實現(xiàn)“藥物性切除”，雌、孕激素水平下降至去勢水平。有研究[13-15]發(fā)現(xiàn)，GnRHa不僅通過降低雌激素直接抑制異位內(nèi)膜的生長，還可通過調(diào)節(jié)細胞因子、受體水平、芳香化酶等作用達到治療效果，并能顯著改善CPP癥狀，縮小病灶、降低術(shù)后復(fù)發(fā)，并提高治療后的妊娠率，現(xiàn)已成為一線治療方案。本研究結(jié)果顯示：EMs患者應(yīng)用GnRHa藥物后，子宮在位內(nèi)膜功能層PGP 9.5的表達較術(shù)前明顯降低，提示應(yīng)用GnRHa藥物緩解EMs相關(guān)疼痛的原因之一是減少了EMs在位子宮內(nèi)膜中神經(jīng)纖維分布密度，即降低PGP 9.5的表達。

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(責(zé)任編輯：周麗萍)

Clinical Significance of Expression of PGP 9.5 in Eutopic Endometrium of Patients with Endometriosis-Related Chronic Pelvic Pain

LUO Yan,LUO Ming-yan

(DepartmentofReproductiveEndocrinology，JiangxiProvincialMaternalandChildHealthHospital，Nanchang330006,China)

Objective To study the expression of protein gene product 9.5(PGP 9.5) in the functional layer of eutopic endometrium and its relation to chronic pelvic pain(CPP) in patients with endometriosis(EMs),and to investigate the role of PGP 9.5 expression and the curative efficacy of gonadotrophin-releasing hormone agonist(GnRHa) in EMs-related CPP.Methods The expression of PGP 9.5 in the functional layer of eutopic endometrium was detected by immunohistochemistry in 40 patients treated with surgery for EMs(EMs group) and 40 women of childbearing age(control group).The degree of CPP and stage of endometriosis were evaluated by using visual analogue scale(VAS) and revised American Fertility Society(rAFS) classification system,respectively.The correlations of VAS and rAFS scores with PGP 9.5 expression were analyzed by using Spearman method.In addition,the expression of PGP 9.5 was detected in EMs patients before and after treatment with GnRHa.Results The expression of PGP 9.5 in the functional layer of eutopic endometrium was 10.48±4.44 in EMs group.No PGP 9.5 expression was found in control group.In patients with EMs-related CPP,PGP 9.5 expression was positively correlated with VAS score(r=0.833，P<0.01),but was not correlated with rAFS score(r=-0.094，P>0.05).After operation,the treatment with GnRHa significantly reduced PGP 9.5 expression and VAS score in patients with EMs(P<0.01).Conclusion The PGP 9.5 is expressed specifically in the functional layer of eutopic endometrium,suggesting that PGP 9.5 may be a new biomarker for early diagnosis of EMs.The high expression of PGP 9.5 in eutopic endometrium is positively correlated with CPP,but is not correlated with rAFS in EMs patients.The GnRHa can relieve the EMs-related CPP through reducing the density of endometrial nerve fibers.

endometriosis; chronic pelvic pain; eutopic endometrium; protein gene product 9.5

2015-06-18

江西省衛(wèi)生廳科技計劃項目(20133123)

羅燕(1981—)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事生殖內(nèi)分泌的基礎(chǔ)與臨床研究。

R 711.71

A

1009-8194(2015)12-0043-04

10.13764/j.cnki.lcsy.2015.12.018