徐曉燕，李穎，王偉，王浩，陳偉

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，泰安 271016)

丹皮總苷對(duì)急性心肌缺血損傷小鼠的保護(hù)作用*

徐曉燕，李穎，王偉，王浩，陳偉

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，泰安 271016)

目的 探討丹皮總苷對(duì)急性心肌缺血缺氧損傷小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 小鼠60只，隨機(jī)分成5組(n=12)，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組(均給予等容量0.9%氯化鈉溶液)及丹皮總苷小、中、大劑量組(分別給予丹皮總苷50，100，200 mg·kg-1)，均每天給藥1次，連續(xù)7 d，末次灌胃后模型對(duì)照組及丹皮總苷組小鼠分別腹腔注射15 mg·kg-1異丙腎上腺素復(fù)制心肌缺血模型。測(cè)定動(dòng)物心電圖T波和J點(diǎn)的變化及血清乳酸脫氫酶(LDH)、心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的變化，并通過Nagar-Olsen染色觀察丹皮總苷對(duì)心肌缺血的影響。結(jié)果 丹皮總苷可明顯降低小鼠心電圖T波及J點(diǎn)的位移，并可改善心肌缺血小鼠相關(guān)生化指標(biāo)。與模型對(duì)照組比較，丹皮總苷大劑量組LDH活力[(898.992±285.108) μmol·mg-1]和MDA含量[(11.737±5.162) nmol·mg-1]均明顯降低，心肌SOD活力[(45.505±20.711) U·mg-1]明顯升高，缺血心肌面積顯著縮小。結(jié)論 丹皮總苷對(duì)急性心肌缺血小鼠具有保護(hù)作用。

丹皮總苷；缺血，心肌，急性；保護(hù)作用

丹皮為毛茛科植物牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)的干燥根皮，具有清熱涼血、活血化瘀之功效。丹皮總苷是從丹皮中提取的活性成分，主要包括芍藥苷、丹皮苷、丹皮原苷、丹皮新苷等苷類化合物，具有廣泛的生物活性[1-4]。丹皮總苷可提高小鼠在缺氧狀態(tài)下的存活率和存活時(shí)間，提高心腦的抗缺氧能力，對(duì)垂體后葉素致心肌缺血具有保護(hù)作用，筆者通過建立異丙腎上腺素致小鼠急性心肌缺血模型，考察丹皮總苷對(duì)急性心肌缺血小鼠心電圖及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)的影響，進(jìn)一步研究其對(duì)心肌缺血的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 昆明種小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量18～22 g，由泰山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：魯動(dòng)質(zhì)字020103，使用許可證號(hào)： SYXK(魯)20120005，飼養(yǎng)環(huán)境的室溫(22±2) ℃，相對(duì)濕度(45±15)%，光照、黑暗交替12 h，自由攝食普通飼料和飲水。

1.2 藥品與試劑 丹皮飲片，批號(hào)：20110301033，購(gòu)自泰安市金泰聯(lián)醫(yī)藥公司；異丙腎上腺素，上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)：100701；芍藥苷對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：20110407；LDH、SOD、MDA及考馬斯亮蘭蛋白測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20110411)。

1.3 儀器 BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)儀(成都泰盟儀器有限公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-95A型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；Bio-rad680酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂公司)；S-54紫外分光光度儀(上海校光技術(shù)有限公司)；凱特離心機(jī)(鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 丹皮總苷的提取和含量測(cè)定 將丹皮飲片與75%乙醇拌勻浸潤(rùn)(料液比1：5)10 h后，回流提取3次，干燥，得粗品。粗品經(jīng)D-101大孔樹脂純化后，得樣品供實(shí)驗(yàn)使用[5]。以芍藥苷為對(duì)照品，10%變色酸為顯色劑，測(cè)得所提樣品中丹皮總苷的含量為74.65%。

1.4.2 動(dòng)物分組、給藥及模型復(fù)制 將小鼠60只隨機(jī)分成5組，每組12只。丹皮總苷小、中、大劑量組分別給予丹皮總苷50，100，200 mg·kg-1；正常對(duì)照組及模型對(duì)照組給予等容量0.9%氯化鈉溶液，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥30 min后腹腔注射烏拉坦1.3 g·kg-1麻醉，用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)描記小鼠標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)正常心電圖，正常對(duì)照組小鼠腹腔注射等容量0.9%氯化鈉溶液，其余組小鼠腹腔注射異丙腎上腺素15 mg·kg-1。連續(xù)記錄腹腔注射異丙腎上腺素后2，5，10 min心電圖，觀察并比較給藥后心肌缺血小鼠J點(diǎn)電壓變化，每時(shí)間點(diǎn)測(cè)3個(gè)連續(xù)的波型，取其平均值[6-7]，并以PR段為基線記錄各組小鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖J點(diǎn)位移(mV)及T波的位移變化。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理 小鼠造模20 min后摘眼球取血，830×g離心，取血清測(cè)定LDH。處死小鼠，取心臟，用0.9%氯化鈉溶液洗凈殘留的血液，濾紙吸干稱重，冰浴下制成5%組織勻漿，830×g離心10 min，取上清液，測(cè)定心肌組織MDA、SOD。取小鼠心臟，固定于10%甲醛溶液，進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.4.4 Nagar-Olsen染色觀察心肌病理改變 心肌組織切片常規(guī)脫蠟入水，入明礬蘇木精液10～30 s，純化水洗，堿性復(fù)紅染液浸染3 min，純化水、丙酮依次洗滌，0.1%苦味酸丙酮液分化5～10 s。丙酮脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片[8]。

2 結(jié)果

2.1 丹皮總苷對(duì)心肌缺血小鼠心電圖的影響

2.1.1 丹皮總苷對(duì)心肌缺血小鼠T波的影響 腹腔注射異丙腎上腺素后2 min，模型對(duì)照組小鼠T波較正常對(duì)照組有明顯位移，位移幅度超過0.1 mV(t=4.057，P<0.01)，10 min時(shí)，T波位移有所減小，但仍超過0.1 mV。與模型對(duì)照組比較，大劑量丹皮總苷能對(duì)抗注射異丙腎上腺素所致的T波位移(t=2.241～6.404，P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 5組小鼠不同時(shí)間心電圖T波位移比較

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01，與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01Compared with normol control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

2.1.2 丹皮總苷對(duì)心肌缺血小鼠J點(diǎn)的影響 腹腔注射異丙腎上腺素后2 min，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠心電圖J點(diǎn)明顯位移，位移幅度超過0.1 mV，10 min時(shí)位移繼續(xù)增加，沒有恢復(fù)(t=5.494，P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，丹皮總苷大、中劑量組心電圖J點(diǎn)的位移顯著降低(t=2.690～3.475，P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 5組小鼠不同時(shí)間心電圖J點(diǎn)位移比較

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01，與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01Compared with normol control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

2.2 丹皮總苷對(duì)心肌缺血小鼠血清LDH的影響 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和丹皮總苷小、中、大劑量組血清LDH含量分別為(900.000±403.131)，(1 645.941±387.824)，(1 164.219±454.525)，(932.332±408.475)，(898.992±285.108)μmol·mg-1。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組LDH上升(t=3.528，P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，丹皮總苷中、大劑量組血清LDH明顯降低(t=3.352，P<0.01)。

2.3 丹皮總苷對(duì)心肌缺血小鼠心肌組織MDA、SOD的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠心肌組織MDA含量升高(t=3.583，P<0.01)，SOD活力明顯下降(t=3.452，P<0.01)，與模型對(duì)照組比較，丹皮總苷中、大劑量組的心肌組織中MDA明顯降低，SOD活力明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.569～3.379，P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 5組小鼠心肌組織中MDA、SOD含量比較

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01，與模型對(duì)照組比較，*2P<0.01，*3P<0.05Compared with normol control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

2.4 丹皮總苷對(duì)小鼠心肌組織Nagar-Olsen染色的影響 Nagar-Olsen染色可以將缺血早期的心肌染成紅色，從而分辨心肌缺血的早期改變。結(jié)果可見，正常對(duì)照組心肌組織呈黃染，模型對(duì)照組缺血心肌呈紅染。與模型對(duì)照組比較，丹皮總苷大劑量組心肌紅染面積顯著減少，黃染面積增多；而丹皮總苷小劑量組雖有部分組織黃染，但仍可見大片紅染的心肌組織。隨著丹皮總苷劑量的增加，小鼠的心肌缺血紅染面積逐漸減少。見圖1。

3 討論

心肌持續(xù)缺血將導(dǎo)致心肌組織損害，并出現(xiàn)ST段、T波缺血性改變，即J點(diǎn)位移，ST段抬高或降低0.1 mV以上，T波高聳或低平均可視為心肌缺血的心電圖表現(xiàn)[9]。異丙腎上腺素為β-受體激動(dòng)藥，大劑量注射可通過增加心臟做功，增加心肌耗氧量，使心肌能量代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致心肌損傷、壞死，同時(shí)由于心肌細(xì)胞膜損傷，使心肌細(xì)胞內(nèi)LDH等釋放入血增加[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠腹腔注射大量異丙腎上腺素后心電圖J點(diǎn)和T波都有明顯位移；血清LDH明顯增加；Nagar-Olsen染色出現(xiàn)大面積紅染現(xiàn)象，提示心肌缺血模型塑造成功。與模型對(duì)照組比較，丹皮總苷組心電圖的J點(diǎn)和T波位移幅度明顯變小，血清LDH顯著降低，缺血紅染面積明顯縮小，表明丹皮總苷對(duì)小鼠缺血性損傷心肌具有保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。

心肌缺血時(shí)可產(chǎn)生大量氧自由基，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，進(jìn)一步代謝生成MDA，這些脂質(zhì)自由基將加劇缺血心肌組織損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，對(duì)異丙腎上腺素所致的脂質(zhì)過氧化，丹皮總苷能明顯提高小鼠心肌的SOD活性，增強(qiáng)了內(nèi)源性氧自由基清除系統(tǒng)的功能，顯著降低心肌MDA的含量。提示丹皮總苷可能是通過減少脂質(zhì)過氧化，提高心肌SOD的活性，抑制氧自由基的產(chǎn)生，提高心肌的抗氧化能力，改善心肌的能量代謝，從而發(fā)揮其抗心肌缺血的保護(hù)作用。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.丹皮總苷小劑量組；D.丹皮總苷中劑量組；E.丹皮總苷大劑量組

A.normal control group；B.model control group；C.low- dose TGM group；D.middle- dose TGM group；E.high-dose TGM group

Fig.1 Nagar-Olsen staining on myocardial tissue in five groups of mice(×100)

[1] 李惠芬，杜凡，周靜，等.牡丹皮中丹皮酚、總苷、多糖單用及合用后的協(xié)同抑菌作用考察[J].天津藥學(xué)，2008，20(2)：10-12.

[2] 胡紅宇，楊郁，于能江，等.牡丹皮的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，2006，31(21)：1793-1794.

[3] 洪浩，王欽茅，趙幟平，等.丹皮多糖-2b對(duì)2型糖尿病大鼠的抗糖尿病作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38(4)：255-256.

[4] 孫國(guó)平，沈玉先，張玲玲，等.丹皮酚的體內(nèi)外抗腫瘤作用[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37(3)：183-184.

[5] 趙新峰，王偉，孫毓慶.毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測(cè)定牡丹皮中芍藥苷的含量[J].中草藥，2003，34(3)： 271-272.

[6] 何勇.黃芪提取物對(duì)心肌缺血損傷的保護(hù)作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2008，19(2)：100-102.

[7] 范麗，袁麗萍，陳志武，等.黃蜀葵花總黃酮對(duì)小鼠急性心肌缺血缺氧損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥房，2005，16(3)：176-177.

[8] 王伯沄.病理學(xué)技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：149.

[9] 陳清啟.ST 段改變與測(cè)量方法[J].臨床心電學(xué)雜志，2005，8(3)：162-163.

[10] 張玲，龍子江，王靚，等.雙丹注射液對(duì)急性心肌缺血模型大鼠心電圖與血清酶的影響[J].中藥藥理與臨床，2006，22(6)：55-56.

[11] 高建，王秋娟，唐玉，等.銀杏內(nèi)酯對(duì)異丙腎上腺素致心肌損傷的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2004，15(3)：151-154.

Protective Effect of Total Glucosides of Mudan Cortex on Acute Myocardial Ischemia in Mice

XU Xiaoyan，LI Ying，WANG Wei，WANG Hao，CHEN Wei

(SchoolofPharmacy，TaishanMedicalCollege，Taian271016 ，China)

Objective To study the protective effect of total glucosides ofMudancortex(TGM)on acute myocardial ischemia in mice and its mechanism. Methods The total of 60 mice were randomly divided into 5 groups (n=12)，normal control and model control (were given equal capacity of 0.9% sodium chloride solution)，and TGM at low，middle，high dose (were given with 50，100，200 mg·kg-1TGM).The mice were administered once daily for consecutive seven days.After the last administration，the mice in the model control and drug groups were treated by intraperitoneal injection of 15 mg·kg-1isoproterenol to to make myocardial ischemia animal model.TGM on the T wave and J point on ECG，and serum lactate dehydrogenase (LDH)，myocardial tissue superoxide dismutase (SOD)，malondialdehyde (MDA) changes was detected，and the extent of myocardial ischemic injury in mice was measured by Nagar-Olsen staining. Results TGM significantly reduced the displacement of ECG T wave and J point，and improved the related biochemical indexes in mice with myocardial ischemia.The activity of LDH[(898.992± 285.108) μmol·mg-1] ，the content of MDA[(11.737 ±5.162) nmol·mg-1]in mice treated with TGM at high dose obviously decreased in comparison to the model controls，and the activity of myocardial SOD[(45.505±20.711) U·mg-1] significantly elevated compared with the model control.It was showed that TGM significantly diminished the areas of cardiac muscles ischemia injured via Nagar-Olsen staining. Conclusion TGM has the remarkable protective effect on acute myocardial ischemia injury in mice.

Total glucosides ofMudancortex(TGM) ; Ischemia，myocardial，acute; Protective effect

2014-09-29

2014-11-09

*山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目(J14LM52)

徐曉燕(1977 -)，女，山東滕州人，講師，碩士，主要從事藥理學(xué)教學(xué)與科研。電話：0538-6229751，E-mail：xyxu@tsmc.edu.cn。

R282.71；R285.5

A

1004-0781(2015)09-1158-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.009