徐元萍，高凌，宋曉暉，周倩

(1.武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心婦產(chǎn)科，武漢 430016；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430060)

17β-雌二醇誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮的作用機(jī)制*

徐元萍1，高凌2，宋曉暉1，周倩1

(1.武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心婦產(chǎn)科，武漢 430016；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430060)

目的 觀察17β-雌二醇(E2)誘導(dǎo)小牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAECs)快速激活并釋放一氧化氮(NO)的時(shí)間和濃度依賴(lài)性趨勢(shì)。方法 采用24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)BAECs分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察不同濃度E2誘導(dǎo)BAECs快速激活并釋放NO的濃度依賴(lài)性趨勢(shì)及非基因組機(jī)制通路。每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。使用電子自旋共振波譜法定量測(cè)定NO的釋放；蛋白免疫印跡法檢測(cè)BAECs一氧化氮合成酶(eNOS)磷酸化的水平。 結(jié)果 終濃度為100 nmol·L-1的E2分別處理BAECs 1，5，10和15 min后，NO的釋放量呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性，在10 min達(dá)到高峰；培養(yǎng)液中加入不同終濃度的E2分別處理BAECs10 min后，NO的釋放量和eNOS的磷酸化均顯示有劑量依賴(lài)性，并在終濃度為100 nmol·L-1時(shí)達(dá)到高峰；培養(yǎng)液中分別加入等體積0.9%氯化鈉溶液、100 nmol·L-1E2和25 μg·mL-1放線菌素D(Act-D)處理BAECs 10 min后，NO釋放量分別為(5.38±2.35)，(10.59±3.28)和(10.68±3.31) nmol·mg-1；eNOS的磷酸化水平分別為0.36±0.03，0.98±0.08和0.99±0.08；與經(jīng)0.9%氯化鈉溶液處理比較，經(jīng)100 nmol·L-1E2處理后，BAECs的NO釋放量和eNOS的磷酸化水平均顯著增加(均P<0.05)。結(jié)論 終濃度為100 nmol·L-1E2可以通過(guò)非基因組機(jī)制快速激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS的磷酸化水平，進(jìn)而可以快速合成和釋放NO發(fā)揮其生物學(xué)作用，10 min即可使此效應(yīng)達(dá)到峰值。

雌二醇；內(nèi)皮細(xì)胞；一氧化氮；一氧化氮合成酶

研究表明，雌激素增加一氧化氮(nitric oxide，NO)的合成和釋放而舒張血管的作用存在基因組和非基因組兩方面機(jī)制：一方面，雌激素可以和細(xì)胞核內(nèi)受體結(jié)合，通過(guò)基因組作用機(jī)制激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)磷酸化從而促進(jìn)NO的合成和釋放，這個(gè)途徑涉及基因轉(zhuǎn)錄，因此作用發(fā)揮需時(shí)較長(zhǎng)，CHAMBLISS等[1]報(bào)道17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)上調(diào)血管eNOS mRNA的表達(dá)至少需要1 h以上；另一方面，雌激素也可以通過(guò)非基因組機(jī)制使血管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS快速磷酸化激活進(jìn)而合成和釋放NO，這是通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活而快速達(dá)到，通常只需要數(shù)分鐘[2]，然而其具體的傳導(dǎo)機(jī)制尚未明了。因此，筆者在本實(shí)驗(yàn)中擬通過(guò)體外培養(yǎng)小牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(bovine aortic endothelial cells，BAECs)，給予不同濃度E2進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)觀察其上調(diào)eNOS的表達(dá)進(jìn)而釋放NO的時(shí)間和濃度依賴(lài)性趨勢(shì)，為后期進(jìn)一步研究雌激素使血管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS快速磷酸化激活進(jìn)而合成和釋放NO的可能分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 BAECs購(gòu)自 Cell Systems(Kirkland，WA)公司；E2(批號(hào)：491187)和小牛血清購(gòu)自Sigma公司。eNOS一抗和磷酸化的eNOS一抗均購(gòu)自Cell Signalling公司；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自Santa Cruz公司；Western雜交顯影(enhanced chemilumine-scence，ECL)試劑盒購(gòu)自Pierce公司；放線菌素D購(gòu)自Calbiochem-Novabiochem公司(批號(hào)：4486950)，其余化學(xué)試劑除另有說(shuō)明外均購(gòu)自Sigma公司。Immunoblot儀器及膠片購(gòu)自BioRad公司。電子旋轉(zhuǎn)共振儀購(gòu)自Noxygen-GmbH公司。每組實(shí)驗(yàn)均使用了3批次BAECs培養(yǎng)重復(fù)3～5次。

1.2 BAECs的培養(yǎng)與觀察 將BAECs在培養(yǎng)條件為37 ℃、5%二氧化碳(CO2)和95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為無(wú)酚紅的DMEM(含10% 碳處理小牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素和1%谷氨酰胺)；倒置顯微鏡下觀察BAECs的形態(tài)學(xué)改變和生長(zhǎng)狀態(tài)，同時(shí)進(jìn)行噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，所有實(shí)驗(yàn)均采用傳代培養(yǎng)第3～5代的BAECs，以1.0×106個(gè)·mL-1的密度接種在24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)前24 h換成不含血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)后分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 E2誘導(dǎo)BAECs釋放NO的時(shí)間依賴(lài)性趨勢(shì)實(shí)驗(yàn) 將BAECs隨機(jī)分為4組(n=6)：培養(yǎng)液中加入生理濃度(100 nmol·L-1)的E2分別處理1，5，10，15 min。

1.2.2 E2誘導(dǎo)BAECs釋放NO的濃度依賴(lài)性趨勢(shì)實(shí)驗(yàn) 將BAECs隨機(jī)分為4組(n=6)：培養(yǎng)液中分別加入終濃度為1，10，100，1 000 nmol·L-1的E2，各處理10 min。

1.2.3 E2誘導(dǎo)BAECs釋放NO的非基因組機(jī)制通路驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 將BAECs隨機(jī)分為3組(n=8)，正常對(duì)照組：培養(yǎng)液中加入等體積0.9%氯化鈉溶液處理10 min；E2組：培養(yǎng)液中加入終濃度為100 nmol·L-1E2處理10 min；放線菌素D處理組(Act-D 組)：培養(yǎng)液中加入25 μg·mL-1放線菌素D處理2 h后再加入終濃度為100 nmol·L-1E2處理10 min。

1.3 NO釋放的測(cè)定 參照參考文獻(xiàn)[3]，采用電子自旋共振波譜法測(cè)定NO的釋放。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即用冷Kreb’s 緩沖液(4 ℃)漂洗BAECs，加入新鮮配制的經(jīng)氮?dú)獬浞诛柡偷奶禺愋择詈衔镆叶虼被姿徼F鹽[diethyl dithicarbamic acid ferrum salt，F(xiàn)e2(DETC)2]膠體(0.5 mmol·L-1)，然后在溫箱內(nèi)孵育60 min，收集細(xì)胞懸液注入1 mL注射器內(nèi)，用液氮速凍成冰柱后置入指狀杜瓦瓶，利用臺(tái)式質(zhì)譜儀(Bruker)分析NO的釋放量。質(zhì)譜儀具體參數(shù)為，橫掃寬度：100 G；頻率：9.74 GHz；微波力：13.26 mW；調(diào)節(jié)幅度：9.82 G；分辨率：512點(diǎn)；接受強(qiáng)度：356。NO釋放量用質(zhì)譜儀圖像中3個(gè)峰的峰頂和谷底的垂直距離表示，單位為蛋白nmol·mg-1。

1.4 蛋白質(zhì)雜交 采用免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)eNOS的磷酸化水平。在各組BAECs中加入細(xì)胞裂解液Buffer A混勻后置于冰上15 min，隨后加入10% NP-40搖床震蕩15 s，離心(12 000×g)10 min，吸棄上清液后加入緩沖液50 μL，于4 ℃離心(12 000×g)10 min，吸取上清液作為組織蛋白提取物，用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)測(cè)定提取液中的蛋白濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)后，從提取液中吸取粗核蛋白50 μg，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離后，蛋白印跡轉(zhuǎn)膜和封阻1 h；用適量稀釋(1：1 000)的eNOS一抗或磷酸化的eNOS一抗，4 ℃孵育雜交過(guò)夜；雜交后按照上述步驟洗膜后再加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫下?lián)u床雜交1 h；ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)陽(yáng)性信號(hào)，采用圖像分析處理系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶掃描分析，記錄積分吸光度值，各組eNOS的磷酸化水平以磷酸化的eNOS與eNOS的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 E2誘導(dǎo)BAECs釋放NO的時(shí)間依賴(lài)性趨勢(shì) 生理濃度(100 nmol·L-1)E2分別處理BAECs 1，5 min后，兩者NO釋放量和eNOS磷酸化水平均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；處理10和15 min后NO釋放量和eNOS的磷酸化水平均顯著增加(t=2.676，2.392，2.753，2.418，均P<0.05)。見(jiàn)表1和圖1。

表1 BAECs 經(jīng)100 nmol·L-1E2處理不同時(shí)間后NO釋放量和eNOS磷酸化水平比較

與處理5 min時(shí)比較，*1P<0.05Compared with 5 min after treatment，*1P<0.05

圖1 BAECs 經(jīng)100 nmol·L-1E2處理不同時(shí)間后eNOS磷酸化水平比較

Fig.1 Comparison of eNOS phosphorylation levels of BAECs at different time points after treatment by 100 nmol·L-1E2

2.2 E2誘導(dǎo)BAECs釋放NO的濃度依賴(lài)性趨勢(shì) 培養(yǎng)液中分別加入1，10 nmol·L-1E2處理BAECs 10 min后，NO釋放量和eNOS的磷酸化水平均沒(méi)有顯著增加(均P>0.05)；分別加入100，1 000 nmol·L-1E2處理BAECs 10 min后，NO釋放量和eNOS的磷酸化水平均顯著增加(t=2.706，2.614，5.458，2.576，均P<0.05)。見(jiàn)表2和圖2。

2.3 E2誘導(dǎo)BAECs釋放NO的非基因組機(jī)制通路 與對(duì)照組比較，E2組和Act-D組的NO釋放量和eNOS的磷酸化水平均顯著增加(t=2.552，2.409，2.469，2.604，均P<0.05)；但E2組和Act-D組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3和圖3。

表2 BAECs經(jīng)不同終濃度E2處理10 min后NO釋放量和eNOS磷酸化水平比較

與10 nmol·L-1E2處理后比較，*1P<0.05Compared with the group treated by 10 nmol·L-1 E2，*1P<0.05

圖2 BAECs經(jīng)不同濃度E2處理后eNOS磷酸化水平比較

Fig.2 Comparison of eNOS phosphorylation levels of BAECs treated by different concentration of E2

表3 3組NO釋放量和eNOS磷酸化水平比較

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.05Compared with normol control group，*1 P<0.05

圖3 3組eNOS磷酸化水平比較

Fig.3 Comparison of eNOS phosphorylation levels among three groups

3 討論

絕經(jīng)是女性體內(nèi)和生殖系統(tǒng)有關(guān)的內(nèi)分泌激素變化的結(jié)果，這些激素主要有雌激素、孕激素和促黃體生成素等。雌激素是一種類(lèi)固醇激素，主要由卵巢和胎盤(pán)產(chǎn)生，以促進(jìn)陰道、子宮、輸卵管和卵巢本身的發(fā)育，同時(shí)還能促使皮下脂肪富集、促使體內(nèi)鈉和水的潴留、骨中鈣的沉積等；卵巢功能衰竭后，雌激素水平急劇下降，引起婦女更年期綜合征，癥狀主要有心血管系統(tǒng)疾病(如冠心病)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病(如糖尿病)及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)退化等。絕經(jīng)前的女性冠心病發(fā)病率僅7‰，而同齡男性的發(fā)病率高達(dá)48‰，兩者相差近7倍；但絕經(jīng)后的女性冠心病發(fā)病率顯著增加，變?yōu)榕c同齡男性相當(dāng)甚至更高[4]。研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)是女性冠心病的一個(gè)獨(dú)特危險(xiǎn)因素，雌激素的心血管保護(hù)作用可能與其激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS磷酸化進(jìn)而釋放NO有關(guān)，但具體的作用機(jī)制還不清楚；雌激素對(duì)心血管的保護(hù)作用主要與NO信號(hào)系統(tǒng)直接相關(guān)[5]。使血管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS快速磷酸化激活進(jìn)而合成和釋放NO依賴(lài)于雌激素受體(estrogen receptor，ER)的作用。

ER包括兩大類(lèi)：一是經(jīng)典的核受體，包括ERa和ERb，均位于細(xì)胞核內(nèi)，介導(dǎo)雌激素的基因組機(jī)制，即雌激素以自由擴(kuò)散形式通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞，并與核內(nèi)ER緊密結(jié)合激活形成ER 同源或異源二聚體，通過(guò)結(jié)合靶基因上的雌激素應(yīng)答元件(estrogen response element，ERE)調(diào)節(jié)基因表達(dá)或與其他核蛋白相互作用以改變基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而使血管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS快速磷酸化激活并促進(jìn)NO的合成和釋放，這個(gè)途徑涉及基因轉(zhuǎn)錄，因此作用發(fā)揮需時(shí)較長(zhǎng)。二是膜性受體，包括經(jīng)典核受體的膜性成分以及屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族的GPER1(GPR30)、Gaq-ER和ER-X，雌激素可以通過(guò)它們介導(dǎo)的非基因組機(jī)制使血管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS快速磷酸化激活進(jìn)而合成和釋放NO，這是通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活而快速達(dá)到的，通常只需要數(shù)分鐘，由于不涉及基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成，故此效應(yīng)不受經(jīng)典核受體拮抗藥、基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)合成抑制劑的影響[2]。因此，筆者通過(guò)體外培養(yǎng) BAECs，給予不同濃度E2進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)觀察其上調(diào)eNOS的表達(dá)進(jìn)而釋放NO的時(shí)間依賴(lài)性趨勢(shì)。由于NO是脂溶性的自由基氣體，攜帶一個(gè)未配對(duì)的電子，在體內(nèi)極不穩(wěn)定，生物半衰期為5 s。以前檢測(cè)NO的方法(如化學(xué)比色法等)很難得到準(zhǔn)確的結(jié)果。鑒于NO為直線形雙原子自由基，其分子構(gòu)型決定了NO是奇電子分子，具有順磁性[6]。因此本研究選擇了采用電子自旋共振波譜儀(electron spin resonance spectroscopy，ESR)檢測(cè)E2誘導(dǎo)BAECs釋放NO的含量。這是一種根據(jù)電子自旋共振波譜吸收程度，檢查組織、細(xì)胞或者其提取液中的自由基，并通過(guò)朗達(dá)(Lande)g因子的測(cè)定來(lái)推斷自由基離子的存在狀態(tài)的方法。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即用冷Kreb’s 緩沖液(4 ℃)漂洗BAECs，加入新鮮配置的經(jīng)氮?dú)獬浞诛柡偷奶禺愋择詈衔颋e2(DETC)2膠體(0.5 mmol·L-1)，然后在溫箱內(nèi)孵育60 min，收集細(xì)胞懸液注入1 mL注射器內(nèi)，用液氮速凍成冰柱后置入指狀杜瓦瓶，最后利用臺(tái)式質(zhì)譜儀(Bruker)圖像中3個(gè)峰的峰頂和谷底的垂直距離來(lái)表示分析NO的釋放量是目前比較先進(jìn)、準(zhǔn)確的方法。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，E2和放線菌素D處理后BAECs的eNOS磷酸化水平及NO釋放量均顯著增加；但E2和放線菌素D之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D沒(méi)有影響E2誘導(dǎo)BAECs快速磷酸化激活eNOS進(jìn)而合成和釋放NO的過(guò)程，這與以往的研究結(jié)果相符合。

總之，本研究結(jié)果表明100 nmol·L-1E2可以通過(guò)非基因組機(jī)制快速激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS的磷酸化水平，進(jìn)而可以快速合成和釋放NO發(fā)揮其生物學(xué)作用。

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Mechanism of 17β-estradiol Induced Nitric Oxide Release from Bovine Aortic Endothelial Cells

XU Yuanping1，GAO Ling2，SONG Xiaohui1，ZHOUQian1

(1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics，WuhanWomenandChildren'sMedicalCareCenter，Wuhan430016，China；2.DepartmentofEndocrinology，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China)

Objective To investigate the time and dose dependent effects of 17 β-estradiol(E2) on eNOS phosphorylation and nitric oxide (NO) production from bovine aortic endothelial cells (BAECs). Methods The BAECs were cultured in 24-well flat plate.The dose dependent rapid induction of NO release by E2in the BAECs was explored，and the non-genomic mechanism was studied.Each experiment was repeated for 3 times.The NO level was quantified by the electron spin resonance spectroscopy(ESR)method，and the phosphorylation of eNOS were determined by Western blot. Results NO release increased time dependently from BAECs after treatment with E2at 100 nmol·L-1at 1，5，10 and 15 min，and the effect peaked at 10 min.There were dose dependent effects of NO production as well as eNOS phosphorylation after treatment with E2at different concentrations for 10 min，and the effect was the most obvious at the concentration of 100 nmol·L-1.Upon treatment with equal volume of saline，E2and actinomycin D (25 μg·mL-1) for 10 min，the NO release was(5.38±2.35)，(10.59±3.28)and(10.68±3.31) nmol·mg-1，respectively，and the eNOS phosphorylation level was 0.36±0.03，0.98±0.08 and 0.99±0.08，respectively.Compared with 0.9% sodium chloride solution，the NO release and eNOS phosphorylation were significantly increased in E2treated cells(allP<0.05). Conclusion 17 β-estradiol at 100 nmol·L-1induced eNOS phosphorylation as well as NO production from bovine vascular endothelial cells through non-genomic mechanism.The effect peaked at 10 minutes.

Estradiol; Endothelial cells; Nitric oxide; Nitric oxide synthase

2014-05-29

2014-11-14

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170767)

徐元萍(1973-)，女，湖北京山人，主治醫(yī)師，碩士，研究方向：婦科內(nèi)分泌、腫瘤、炎癥的臨床及基礎(chǔ)研究。電話：(0)13659800706，E-mail：462888137@qq.com。

高凌(1973-)，男，湖北武漢人，副主任醫(yī)師，副教授，博士，研究方向：內(nèi)分泌疾病的臨床及基礎(chǔ)研究。電話：(0)18907102990，E-mail：ling.gao@medmail.com.cn。

R977.2；R965

A

1004-0781(2015)09-1142-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.005