翟鳳國(guó)，周福波，李厚忠，郭素芬，林峰，關(guān)利新

(牡丹江醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，牡丹江 157011)

·藥物研究·

蒺藜皂苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性的影響*

翟鳳國(guó)，周福波，李厚忠，郭素芬，林峰，關(guān)利新

(牡丹江醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，牡丹江 157011)

目的 探討蒺藜皂苷對(duì)大鼠腦缺血-再灌注損傷炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性的作用及其機(jī)制。方法 斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)大鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、蒺藜皂苷小劑量組(10 mg·kg-1)、蒺藜皂苷大劑量組(30 mg·kg-1)，每組15只，采用線栓法制備腦缺血-再灌注損傷模型。缺血2 h再灌注24 h后分別檢測(cè)大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分、缺血腦組織髓過氧化物酶(MPO)的活性和伊文思藍(lán)(EB)的含量；采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)腦組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量，免疫印記法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)變化。結(jié)果 與模型對(duì)照組比較，蒺藜皂苷小、大劑量組大鼠神經(jīng)功能損傷減輕(P<0.05)，缺血腦組織MPO活性和EB含量均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，TNF-α含量明顯降低[分別為(0.760±0.110)，(0.670±0.073)mg·g-1，模型對(duì)照組為(0.920±0.128)mg·g-1，P<0.05或P<0.01)]，MMP-9 的表達(dá)水平均明顯降低[分別為(1.770±0.181)%，(1.480±0.146)%，模型對(duì)照組為(2.200±0.186)%，P<0.01]。結(jié)論 蒺藜皂苷對(duì)大鼠腦缺血-再灌注損傷的腦組織具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低TNF-α含量和下調(diào)MMP-9表達(dá)，從而降低炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性有關(guān)。

蒺藜皂苷；缺血-再灌注，腦；炎癥；血腦屏障；基質(zhì)金屬蛋白酶

缺血性腦血管病是危害人類生命和健康的常見病，其所涉及的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，腦缺血-再灌注是多數(shù)缺血性腦血管病的主要病理生理過程。腦缺血-再灌注損傷發(fā)生后，血-腦屏障破壞，腦組織水腫，同時(shí)炎癥細(xì)胞也更易于通過破壞的血腦屏障，浸潤(rùn)到腦組織中，加重腦組織損傷[1-2]。蒺藜皂苷是從蒺藜地上全草中提取的有效組分之一，是以甾體皂苷為主的十多種皂苷的混合物，臨床主要用于心腦血管疾病的治療。研究表明，蒺藜皂苷對(duì)腦缺血損傷具有腦保護(hù)作用[3-4]，但蒺藜皂苷對(duì)炎癥反應(yīng)和血腦屏障作用的相關(guān)研究較少，筆者進(jìn)一步探討蒺藜皂苷在腦缺血-再灌注損傷時(shí)腦保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠60只，體質(zhì)量270～320 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001；合格證號(hào)：114007-00059799]。所有大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水和攝食，室內(nèi)安靜，每日光照12 h，室溫控制在 20～25 ℃，相對(duì)濕度(60±40)%。

1.2 藥品及試劑 蒺藜皂苷由吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司提供，含量>90%。伊文思藍(lán)(Evans blue，EB)染料購于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：20110616)。髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20110906)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(批號(hào)：20110813)購自南京建成生物技術(shù)公司。兔抗大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)多克隆抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3 動(dòng)物分組及給藥 將大鼠隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、模型對(duì)照組、蒺藜皂苷小劑量(10 mg·kg-1)組和蒺藜皂苷大劑量(30 mg·kg-1)組，每組15只。給藥組均于術(shù)前灌胃給藥7 d，每天灌胃1次。模型對(duì)照組和假手術(shù)組給予相同體積0.9%氯化鈉注射液。

1.4 腦缺血模型的制備 根據(jù)LONGA線栓法[5-6]加以改進(jìn)，10%水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，取頸部正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總和頸內(nèi)、外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈。在頸外動(dòng)脈近分叉處剪一“V”形切口，插入頭端燒圓涂蠟呈鈍形的直徑為 0.245 mm 的尼龍魚線，線栓插入深度18～20 mm(距離頸總動(dòng)脈分叉點(diǎn))，有輕微阻力時(shí)停止，扎緊并固定栓線，縫合皮膚，2 h后抽提栓線至頸總動(dòng)脈內(nèi)制備再灌注損傷模型。假手術(shù)組只分離血管，不插入尼龍線。

1.5 神經(jīng)功能損傷評(píng)分 參照LONGA等[5]介紹的5分法對(duì)腦缺血24 h后 的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：提尾懸空不能伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：行走向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走困難，并向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，伴意識(shí)障礙。神經(jīng)功能缺損達(dá) 1～3 分者納入實(shí)驗(yàn)。

1.6 腦組織EB含量的測(cè)定 腦缺血23 h后，經(jīng)舌下靜脈注射2% EB溶液1 mL，大鼠全身迅速變藍(lán)。1 h后，處死大鼠，取出大腦，將缺血側(cè)大腦組織勻漿置于50%三氯醋酸中混勻，放置24 h，測(cè)定620 nm處吸光度(A)值。同時(shí)測(cè)定已知濃度的梯度EB溶液的A值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的EB含量。

1.7 腦組織MPO活性測(cè)定 取缺血側(cè)大鼠腦組織，利用試劑盒提供的勻漿介質(zhì)，將腦組織制成 10%組織勻漿，按MPO試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量。

1.8 腦組織TNF-α的含量測(cè)定 取缺血側(cè)大鼠腦組織，勻漿，按ELISA檢測(cè)試劑盒說明書步驟操作測(cè)定腦組織中TNF-α的表達(dá)。

1.9 免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)腦組織MMP-9的表達(dá)水平 取缺血側(cè)大鼠腦組織100 mg加入到1 mL蛋白裂解液，勻漿，離心提取總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)灌膠、上樣、10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟后，分別加入兔抗大鼠 MMP-9 多克隆抗體(1：500)、鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1：1 000)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1：2 000)，室溫孵育2 h，再經(jīng)洗膜緩沖液洗膜，超敏電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)試劑盒A液和B液反應(yīng)，壓片、X線膠片曝光顯影、圖像采集。再用Image Pro-Plug 610圖像分析軟件測(cè)定目的條帶的累積A值，以β-actin為內(nèi)參照，以目的條帶的累積A值與β-actin條帶的累積A值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 蒺藜皂苷對(duì)大鼠腦缺血神經(jīng)功能損傷的影響 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能無損傷，腦缺血-再灌注24 h 后，模型對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分與假手術(shù)組比較顯著增高，蒺藜皂苷能減輕腦缺血-再灌注大鼠的神經(jīng)功能損傷評(píng)分(F=17.14，P<0.05)。結(jié)果見表1。

2.2 蒺藜皂苷對(duì)大鼠腦組織EB含量的影響 腦缺血-再灌注24 h后，大鼠腦組織EB含量明顯增高；與模型對(duì)照組比較，蒺藜皂苷小劑量組和大劑量組缺血腦組織EB含量均明顯降低(F=21.08，P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 4組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦組織EB含量比較

與假手術(shù)組比較，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01Compared with sham operation group，*1P<0.01; compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

2.3 蒺藜皂苷對(duì)大鼠腦組織MPO活性的影響 腦缺血-再灌注24 h后大鼠腦組織MPO活性明顯增高；與模型對(duì)照組比較，蒺藜皂苷小劑量組和大劑量組缺血腦組織MPO的活性均明顯降低(F=52.01，P<0.01)。結(jié)果見表2。

2.4 蒺藜皂苷對(duì)大鼠腦組織TNF-α含量的影響 腦缺血-再灌注24 h后，大鼠腦組織TNF-α的含量明顯增高。與模型對(duì)照組比較，蒺藜皂苷小劑量組和大劑量組缺血腦組織TNF-α的含量均明顯降低(F=33.40，P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 4組大鼠腦組織MPO活性和TNF-α含量比較

與假手術(shù)組比較，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01Compared with sham operation group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

2.5 蒺藜皂苷對(duì)大鼠腦組織MMP-9表達(dá)水平的影響 腦缺血-再灌注24 h后，大鼠腦組織MMP-9的蛋白表達(dá)水平明顯增高。與模型對(duì)照組比較，蒺藜皂苷小劑量組和大劑量組缺血腦組織MMP-9 蛋白表達(dá)水平均明顯降低。與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注24 h后大鼠腦組織MMP-9的蛋白表達(dá)水平明顯增高[(1.280±0.143)%，(2.200±0.186)%，P<0.01]。而與模型對(duì)照組比較，蒺藜皂苷小劑量組和大劑量組缺血腦組織MMP-9 的蛋白表達(dá)水平均明顯降低[(1.770±0.181)%，(1.480±0.146)%，F(xiàn)=30.39，P<0.01]。見圖1。

圖1 4組大鼠腦組織MMP-9的表達(dá)

Fig.1 MMP-9 expression in brain in four groups of rats

3 討論

腦缺血-再灌注后炎癥反應(yīng)和炎癥因子的釋放可以增加血腦屏障通透性，而血腦屏障通透性的增加一方面加重腦水腫，另一方面有利于炎癥因子和炎癥細(xì)胞通過血腦屏障，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[7-8]。因此，抑制炎癥、降低血腦屏障通透性從而減輕腦缺血-再灌注損傷是臨床治療目的之一。

本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腦缺血-再灌注模型，證實(shí)了蒺藜皂苷具有減輕腦缺血神經(jīng)功能損傷作用，即蒺藜皂苷對(duì)大鼠腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用，這與以往研究一致[3-4]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，蒺藜皂苷治療組缺血腦組織中MPO活性均明顯降低。MPO是中性粒細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其活性可反映中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度及組織炎癥反應(yīng)的程度[9]。提示蒺藜皂苷可顯著減輕腦缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。蒺藜皂苷可明顯降低腦組織TNF-α的含量。TNF-α是體內(nèi)最重要的炎癥遞質(zhì)之一，研究表明腦缺血早期TNF-α水平增高，且與神經(jīng)功能缺損程度相關(guān)[10]。TNF-α的激活在腦缺血炎癥反應(yīng)中起著核心作用，介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及炎癥遞質(zhì)等的表達(dá)，加重腦損傷，擴(kuò)大腦梗死體積[11]。蒺藜皂苷可能是通過減少TNF-α的表達(dá)來抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕腦缺血-再灌注損傷。

EB是小分子指示劑，與血漿蛋白結(jié)合后不能通過

血腦屏障，只有當(dāng)血腦屏障破壞時(shí)才進(jìn)入腦組織，可作為評(píng)估血腦屏障損傷的定性指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，蒺藜皂苷可明顯降低缺血腦組織EB的含量，表明蒺藜皂苷可減輕腦缺血-再灌注損傷所致的血腦屏障破壞。蒺藜皂苷也可明顯降低缺血腦組織MMP-9 的蛋白表達(dá)水平。MMPs是分解細(xì)胞外基質(zhì)最重要的一類蛋白酶類。研究表明腦缺血后MMPs分解細(xì)胞外基質(zhì)、破壞基底膜并開放血腦屏障是導(dǎo)致腦缺血-再灌注損傷病情加重的重要因素之一[12]。MMP-9是MMPs家族的主要成員，其表達(dá)量和活性的增高可促進(jìn)血腦屏障通透性的增高，促進(jìn)腦水腫和白細(xì)胞浸潤(rùn)，早期選擇性抑制MMP-9可顯著減輕腦梗死[13]。因此，推測(cè)蒺藜皂苷可能是通過降低 MMP-9 的表達(dá)改善血腦屏障的完整性，從而減輕缺血性腦損傷。

綜上所述，蒺藜皂苷可能通過抑制 TNF-α 的表達(dá)、減輕炎癥反應(yīng)，抑制 MMP-9 表達(dá)、減輕血腦屏障破壞，進(jìn)而減輕大鼠腦缺血-再灌注損傷，發(fā)揮其對(duì)大鼠腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用。

[1] DEL ZOPPO G J.Microvascular responses to cerebral is-chemia/inflammation[J].Ann N Y Acad Sci，1997，823(1)：132-147.

[2] TOBIN M K，BONDS J A，MINSHALL R D，et al.Neu-rogenesis and inflammation after ischemic stroke：what is known and where we go from here[J].J Cereb Blood Flow Metab，2014，34(10)：1573-1584.

[3] 關(guān)欣，紀(jì)影實(shí)，李紅，等.蒺藜皂苷對(duì)腦缺血-再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用[J].中草藥，2006，37(6)：904-906.

[4] 王承，李玉書，王萍，等.蒺藜皂苷對(duì)急性不完全腦缺血損傷的保護(hù)作用[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，42(5)：456-458.

[5] LONGA E Z，WEINSTEIN P R，CARLSON S，et al.Rev-ersible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1)：84-91.

[6] 唐焜，謝小慧，陳志達(dá)，等.仙人掌多糖對(duì)大鼠局灶性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31(9)：1109-1112.

[7] KRAFT P，SCHWARZ T，GOB E，et al.The phosphodi-esterase-4 inhibitor rolipram protects from ischemic stroke in mice by reducing blood-brain-barrier damage，inflammation and thrombosis[J].Exp Neurol，2013，247(1)：80-90.

[8] KELLY M A，SHUAIB A，TODD K G.Matrix metallo-proteinase activation and blood-brain barrier breakdown following thrombolysis[J].Exp Neurol，2006，200(1)：38-49.

[9] TU X K，YANG W Z，SHI S S，et al.Spatio-temporal dis-tribution of inflammatory reaction and expression of TLR2/4 signaling pathway in rat brain following permanent focal cerebral ischemia[J].Neurochem Res，2010，35(8)：1147-1155.

[10] YOON J S，LEE J H，TWEEDIE D，et al.3，6'-dithiothali-domide improves experimental stroke outcome by suppressing neuroinflammation[J].J Neurosci Res，2013，91(5)：671-680.

[11] KANG G H，YAN B C，CHO G S，et al.Neuroprotective effect of fucoidin on lipopolysaccharide accelerated cerebral ischemic injury through inhibition of cytokine expression and neutrophil infiltration[J].J Neurol Sci，2012，318(1/2)：25-30.

[12] VILALTA A，SAHUQUILLO B J，POCA M A.Matrix meta-loproteinases in neurological brain lesions：a new therapeutic target[J].Rev Neurol，2010，51(2)：95-107.

[13] ZHOU D，LI M，HU H，et al.HuoxueRongluotablet reduces matrix metalloproteinase-9 expression in infarcted brain tissue[J].Neural Regen Res，2013，8(34)：3216-3224.

Effects of Gross Saponins of Tribulus terrestris L. on Inflammatory Reaction and Permeability of Blood-brain Barrier in Rats Following Cerebral Ischemic Injury

ZHAI Fengguo，ZHOU Fubo，LI Houzhong，GUO Sufen，LIN Feng，GUAN Lixin

(DepartmentofPharmacology，MudanjiangMedicalUniversity，Mudanjiang157011，China)

Objective To explore the effects of gross saponins ofTribulusterrestrisL.on inflammatory reaction and permeability of blood-brain barrier in rats following cerebral ischemia-reperfusion injury and their potential mechanisms. Methods Sixty SD rats were divided into sham operation group，model control group，gross saponins ofTribulusterrestrisL.at low-dose (10 mg·kg-1)and high-dose groups(30 mg·kg-1).Cerebral ischemia -reperfusion model was established with suture emboli method in middle cerebral artery of rats.Neural injury scores，the contents of Evans blue (EB) and myeloperoxidase( MPO) activities in rat brain were measured 24 hours after the cerebral reperfusion post 2 h ischemia.Content of tumor necrosis factor-α (TNF-α) in rat brain was detected by ELISA; expression levels of matrix metalloproteinase-9(MMP-9) in rat brain was determined by Western blot. Results Compared to the model control group，the neurological deficit scores were significantly decreased(P<0.05)，MPO activities and EB contents decreased(P<0.05 orP<0.01)in the treatment groups.The expression levels of TNF-α were significantly lower in the treatment groups(0.760±0.110) mg·g-1and (0.670±0.073) mg·g-1compared to (0.920±0.128) mg·g-1in the model control group (P<0.05 orP<0.01).The MMP-9 expression levels were (1.770±0.181)% and(1.480±0.146)%，significantly lower than(2.200±0.186)% in the model control group(P<0.01). Conclusion Gross saponins ofTribulusterrestrisL.exert neuroprotective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats through inhibiting the inflammatory reaction and decreasing the permeability of blood-brain barrier，which may be associated with the decrease of the TNF-α content and downregulation of the MMP-9 expression.

Gross saponins ofTribulusterrestrisL.;Ischemia-reperfusion， cerebral;Inflammation; Blood-brain barrier; Matrix metalloproteinase

2014-04-22

2014-09-23

*黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(11551527)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(2012-276)；牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2010-02)

翟鳳國(guó)(1974-)，女，黑龍江鶴崗人，副教授，博士，研究方向：心腦血管病藥理。電話：(0)15145331192，E-mail：zhaifengguo1974@163.com。

關(guān)利新(1960-)，男，黑龍江牡丹江人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心腦血管病藥理。電話：0453-6984213，E-mail：guanlixin777@163.com。

R282.71；R285

A

1004-0781(2015)09-1131-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.002