金妙妙 傅健飛

（浙江省金華市中心醫(yī)院，浙江 金華 321000）

·研究報告·

陽和化巖湯對大鼠乳腺癌癌前病變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響*

金妙妙 傅健飛

（浙江省金華市中心醫(yī)院，浙江 金華 321000）

目的觀察陽和化巖湯對大鼠乳腺癌癌前病變后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變情況。方法選取大鼠30只建立大鼠乳腺癌癌前病變模型，另取10為空白組，9周后進行分組并采取不同藥物干預(yù)4周，觀察大鼠腫瘤出現(xiàn)情況，取乳腺組織進行HE染色觀察組織病理形態(tài)學(xué)變化，在透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果大鼠組織形態(tài)學(xué)上，空白對照組全部為一般增生，為100.00%，與陽和化巖湯、平消片組、模型組在一般增生、癌前病變、浸潤性癌發(fā)生率上比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在表面結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核、細(xì)胞凋亡和肌上皮超微表現(xiàn)上，模型組和其他3組在評分上比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），陽和化巖湯組和空白對照組、模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞器和胞質(zhì)內(nèi)含物超微表現(xiàn)進行比較，模型組和陽和化巖湯組、空白對照組在評分上比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），陽和化巖湯組和空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論陽和化巖湯具有抑制大鼠乳腺癌前病變細(xì)胞生長和代謝功能，主要是細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度變化。

陽和化巖湯 大鼠 乳腺癌 癌前病變 超微結(jié)構(gòu)

乳腺癌癌前病變是乳腺癌發(fā)展的必然經(jīng)過，但在臨床上予合適的措施進行阻斷和干預(yù)，能提高乳腺癌預(yù)后。研究稱，乳腺癌前病變在治療上方法較多，最常見的是藥物干預(yù)治療，其中以中醫(yī)藥干預(yù)報道最常見，其臨床有效率占60%以上［1］，目前臨床上著重報道的是中醫(yī)藥在宏觀上對乳腺癌癌前病變作用，很少從微觀角度進行分析。本次研究通過觀察陽和化巖湯對大鼠乳腺癌癌前病變后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，以期從微觀上進行分析。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 雌性未育大鼠，鼠齡6周左右，體質(zhì)量為220~240 g，共40只，采用山東大學(xué)實驗室提供的飼料，均由上海復(fù)旦大學(xué)動物實驗室提供，許可證為SCXK（滬）2013002，試驗動物許可證為SYXK（滬）20130017，均經(jīng)相關(guān)部位同意后進行研究。

1.2 試藥與儀器 陽和化巖湯，藥物組成：鹿角霜12 g，熟地黃10 g，肉桂6 g，莪術(shù)10 g，山慈菇15 g，浙貝母10 g，肉桂6 g，白芥子3 g，甘草6 g。平消片（寧夏金太陽藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z64020166，0.23 g/片，主要成分：郁金、仙鶴草、五靈脂、白礬、硝石、干漆、枳殼、馬錢子粉）。二甲基苯并蒽（上海寶曼生物科技有限公司，生產(chǎn)批號為2012-3-13）。透視電子顯微鏡由日本西門子公司提供，電子顯微鏡型號為81W/AIS2100。

1.3 造模與給藥 造模大鼠分3次灌注二甲基苯并蒽，每次劑量為50 mg/kg，周期為3周1次，共9周。造模成功后分成3組，每組10例，另取10只為空白對照組，予飲用水常規(guī)飼養(yǎng)。陽和化巖湯組予中藥湯劑取汁200 mL，以20 mL/kg灌胃，連續(xù)4周。平消片組予平消片6片溶于0.9%氯化鈉注射液200mL中，用藥劑量等同中藥組。造模組則造模成功后予飲用水，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 取正常大鼠第2對乳房，出現(xiàn)腫瘤組則取腫瘤組織，直徑約為0.5 cm，浸入10%甲醛中固定1 d，然后取材、脫水、透明、浸蠟、包埋后切片，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片。然后取新鮮組織，快速用PB沖洗后放入3%戊二醛固定液中，將樣品修復(fù)成1 mm×1 mm×2 mm，置于新鮮3%戊二醛，常規(guī)TEM樣品制備漂洗后固定，漂洗，脫水，浸透，包埋后行超薄切片，用檸檬酸鉛和醋酸鈾離子染色，在透射電鏡下觀察。觀察內(nèi)容包括細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)中的橋粒，縫隙連接，鑲嵌連接和微絨毛；細(xì)胞器和其內(nèi)的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、微絲和微管、脂滴、溶酶體和胞質(zhì)內(nèi)腔；細(xì)胞核中的核規(guī)則程度、異染色質(zhì)、核仁和核/漿比例。

1.5 超微結(jié)構(gòu)評分方法 1）細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)超微評分［2］：微絨毛整齊數(shù)量分為多、一般和少3個等級，分別計為3分、2分、1分；細(xì)胞間縫隙連接分成良好、一般、差，分別計為3分、2分、1分；橋粒分成豐富、一般、不豐富，分別計為3分、2分、1分。2）細(xì)胞器和胞質(zhì)內(nèi)含物超微評分［3］：線粒體、微絲微管形態(tài)分成正常、一般、差，分別計為3分、2分、1分；溶酶體、高爾基復(fù)合體分成不發(fā)達、一般、發(fā)達，分別計為3分、2分、1分；游離核糖體、脂滴數(shù)量分為正常、稍多、增多，分別計為3分、2分、1分；胞質(zhì)內(nèi)腔分為無、少見、增多，分別計為3分、2分、1分。3）細(xì)胞核超微評分［4］：細(xì)胞核、染色質(zhì)、核漿三者正常為3分，一般為2分，差為1分。細(xì)胞凋亡和肌上皮超微評分：凋亡體分成未出現(xiàn)、少見和常見，分別計為3分、2分、1分；肌上皮細(xì)胞分成正常、不典型和消失，分別計為3分、2分、1分。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）檢驗，組間t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠乳腺組織病理形態(tài)學(xué)比較 見表1。大鼠組織形態(tài)學(xué)上，空白對照組全部為一般增生，為100.00%，與陽和化巖湯組、平消片組、模型組在一般增生、癌前病變、浸潤性癌發(fā)生率上比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 大鼠乳腺組織病理形態(tài)學(xué)比較n（%）

2.2 大鼠乳腺細(xì)胞超微表現(xiàn)評分比較 見表2。在表面結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核、細(xì)胞凋亡和肌上皮超微表現(xiàn)上，模型組和其他3組在評分上比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），陽和化巖湯組和空白對照組、模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠乳腺細(xì)胞超微表現(xiàn)評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠乳腺細(xì)胞超微表現(xiàn)評分比較（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與陽和化巖湯組比較，△P＜0.05。。

組 別 n 細(xì)胞表面結(jié)構(gòu) 乳腺細(xì)胞核 乳腺細(xì)胞凋亡和肌上皮 乳腺細(xì)胞器和胞質(zhì)內(nèi)含物空白對照組 11陽和化巖湯組 15平消片組 12 8.56±1.12*△11.67±0.53*△5.84±0.31*△23.15±0.74△6.23±1.54*8.78±2.12*4.55±1.02*16.57±3.45 5.56±1.32*8.24±2.09 4.01±1.04 15.85±4.12模型組 13 4.56±1.14△7.32±1.83△3.79±0.78△14.51±2.15△

圖1 陽和化巖湯組大鼠乳腺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖

2.3 大鼠乳腺細(xì)胞器和胞質(zhì)內(nèi)含物超微表現(xiàn)比較見表2，圖1。對大鼠乳腺細(xì)胞器和胞質(zhì)內(nèi)含物超微表現(xiàn)進行比較，模型組與陽和化巖湯組、空白對照組在評分上比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），陽和化巖湯組和空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

結(jié)果顯示，在表面結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核、細(xì)胞凋亡和肌上皮超微表現(xiàn)上，空白對照組大鼠細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)評分明顯高于其他組，且有明顯差異。其在電鏡下表現(xiàn)為乳腺導(dǎo)管細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，橋粒豐富，相鄰組織間隙連接或鑲嵌連接為主，細(xì)胞腔內(nèi)絨毛豐富且整齊，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器正常，線粒體圓形，體積較小，可見核糖體，高爾基體和游離核糖體不豐富，細(xì)胞核規(guī)則不明顯，核內(nèi)染色質(zhì)較少，基底膜連續(xù)，肌上皮細(xì)胞正常。這點和文獻［5］結(jié)果是類似的。

結(jié)果顯示，細(xì)胞器和胞內(nèi)含物中，模型組和平消片比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。模型組在乳腺組織HE染色下表現(xiàn)為浸潤性乳腺癌，電鏡吸收超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為細(xì)胞膜去分化改變，微絨毛短平、不整齊，橋粒減少和消失，細(xì)胞間緊密連接為主，松散變寬，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，線粒體增多，體積較大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增多且腫脹明顯，溶酶體增多，這說明了癌細(xì)胞蛋白合成功能較強，胞質(zhì)內(nèi)數(shù)量明顯增加，細(xì)胞核中形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞基底膜和肌上皮細(xì)胞消失，藥物治療后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，特別是陽和化巖湯組，在細(xì)胞膜、胞內(nèi)、胞質(zhì)等超微結(jié)構(gòu)均有明顯改善。

結(jié)果顯示，陽和化巖湯和其他各組在細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)上比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而在細(xì)胞器和胞內(nèi)含物上陽和化巖湯比平消片評分較高，在細(xì)胞核上也有類似情況。其在乳腺組織HE染色形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為一般增生和癌前病變，浸潤性病變等不同表現(xiàn)，其在電鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)育不良和去分化，微絨毛逐漸恢復(fù)正常，細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)不清，縫隙連接減少，發(fā)育不良，這點和報道［6］結(jié)果一致，說明了該藥物對改善細(xì)胞間結(jié)構(gòu)作用顯著；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，線粒體等增多明顯，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)豐富，高爾基體可見大量脂滴和乳蛋白顆粒，細(xì)胞核形態(tài)大小等規(guī)則，可見體積增大，核內(nèi)常染色體豐富，核漿比例失調(diào)，其原因可能是由于藥物中貝母等有豐富細(xì)胞線粒體效果有關(guān)［7］?；啄みB續(xù)，肌上皮細(xì)胞不同程度異常，可加凋亡細(xì)胞，這可能和中藥湯劑具有促進組織新陳代謝有關(guān)［8］?？傊摐珓┰诟纳萍?xì)胞表面結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡上和其他藥物是類似的，在胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和胞核上，該湯劑則明顯優(yōu)于平消片?？傊柡突瘞r湯在改善細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)上具有明顯改善，在抑制大鼠乳腺癌前病變細(xì)胞生長和代謝功能上均有較好作用。

［1］ 閔大六，王保太，孟剛，等.乳腺癌和癌前病變中細(xì)胞凋亡及其與bcl-2、PCNA表達的關(guān)系［J］.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2012，15（2）：99-102.

［2］ 李靜蔚，劉曉菲，陳宏志，等.溫陽散結(jié)法干預(yù)乳腺癌癌前病變MCF-10AT細(xì)胞的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2013，41（4）：41-45.

［3］ 劉曉菲，李靜蔚，陳翰翰，等.溫陽散結(jié)法干預(yù)乳腺癌癌前病變MCF-10AT細(xì)胞的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡研究［C］.//中華中醫(yī)藥學(xué)會2013年學(xué)術(shù)年會論文集，2013：175-178.

［4］ 劉文英，裴曉華.中醫(yī)藥防治乳腺癌癌前病變的研究進展［C］. //第11屆全國中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合乳腺病學(xué)術(shù)會議論文集，2012：472-475.

［5］ 李龍山，孫東植，孫抒，等.乳腺癌及其癌前病變中細(xì)胞凋亡與p53、bcl-2蛋白的表達［J］.中國腫瘤臨床，2013，27（5）：329-332.

［6］ 李永健.乳寧沖劑干預(yù)MCF-10AT細(xì)胞及其乳腺癌癌前病變模型的實驗研究［D］.上海：上海中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

［7］ 鄧衛(wèi)芳.化瘀解毒法對乳腺癌癌前病變大鼠SDF-1/CXCR4軸表達的影響［C］.//2012年中醫(yī)外科學(xué)術(shù)年會論文集，2012：182-186.

［8］ 李穎嘉，孫學(xué)剛，文戈，等.乳腺癌及癌前病變血管生成相關(guān)分子的表達及意義［J］.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2012，18（3）：316-321.

The Effect of Yanghe Huayan Tang on the Ultrastructure of Precancerous Iesions Cell of Breast Cancer in Rat

JIN Miaomiao，F(xiàn)U Jianfei.Jinhua Central Hospital of Zhejiang Province，Zhejiang Jinhua 321000，China

Objective：to observe the effect of Yanghe Huayan Tang on the histopathological changes of rat after Precancerous lesions of breast cancer.Methods：30 rats were chosen to establish the rat model of precancerous lesions of breast cancer.Another 10 rats were in the control group.9 weeks later，the rats were divided into groups，and different medicines were taken to intervene，lasting for 4 weeks.Rats were observed in body mass and tumor growth situations.The breast tissue was taken to observe the histopathological changes of HE staining and the ultrastructure of cell with the TEM.Results：In the histomorphology of rats，the control group were all general hyperplasia 100%.There were statistical differences in general hyperplasia，precancerous lesions and the incidence of infiltrating cancer among Yanghe Huayan Tang group，the flat plate group，the model group.In the surface structure，compared with the other 3 groups，the evaluation of the model group had statistical significant differences（P＜0.05）in nucleus，apoptosis and myoepithelial ultra performance.The differences among Yanghe Huayan Tang group，the control group and the model group had statistical meaning（P＜0.05）.In nucleus，apoptosis and myoepithelial ultra performance，the differences among Yanghe Huayan Tang group，the control group and the model group had statistical meaning（P＜0.05）.The differences betweeen Yanghe Huayan Tang group and the control group had statistical meaning（P＜0.05）.Conclusion：Yanghe Huayan Tang has the function of inhibiting the growth and metabolism of the precancerous lesions cells，mainly expressed by the changes of the ultrastructure of membranes，cytoplasm and nucleus in different degrees.

Yanghe Huayan Tang；Rat；Breast cancer；Precancerous lesions；Ultrastructure

R285.5

A

1004-745X（2015）07-1162-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.07.012

2015-03-02）

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY13H190006）