劉新迎巫祖強李 蓉林智勇梁佩玲董 燕王培訓(xùn)

（1.廣東省佛山市南海區(qū)羅村醫(yī)院，廣東 佛山 528226；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510405）

·研究報告·

燈盞細辛合尼莫地平對谷氨酸所致神經(jīng)元凋亡的影響*

劉新迎1巫祖強1李 蓉1林智勇1梁佩玲1董 燕2王培訓(xùn)2

（1.廣東省佛山市南海區(qū)羅村醫(yī)院，廣東 佛山 528226；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510405）

目的觀察燈盞細辛合尼莫地平對谷氨酸所致PC12細胞凋亡的影響。方法培養(yǎng)PC12細胞，并用谷氨酸誘導(dǎo)建立神經(jīng)細胞損傷模型，用流式細胞儀觀察尼莫地平以及燈盞細辛合尼莫地平共作用對PC12細胞凋亡的影響。結(jié)果尼莫地平10、20 μmol/L濃度組作用2 h和尼莫地平3個濃度組作用4 h對神經(jīng)細胞凋亡均具有保護作用，燈盞細辛與尼莫地平3個濃度組合用，作用2 h和4 h對神經(jīng)細胞凋亡均具有保護作用。結(jié)論尼莫地平對神經(jīng)細胞凋亡的保護作用，具有時間和劑量依賴性，燈盞細辛與尼莫地平合用能有效減少和降低尼莫地平的用量和作用時間，達到神經(jīng)細胞保護作用。

燈盞細辛 尼莫地平 谷氨酸 神經(jīng)元凋亡

缺血性腦卒中占全部腦卒中的60%～85%［1］，嚴重影響了患者的生存質(zhì)量，帶來了嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)。缺血性腦卒中級聯(lián)損傷的“瀑布反應(yīng)”是非線性和循環(huán)的，采用作用機制多樣的神經(jīng)保護劑，或聯(lián)合作用于級聯(lián)反應(yīng)不同環(huán)節(jié)的幾種神經(jīng)保護劑，即神經(jīng)保護劑雞尾酒療法可能是阻斷腦缺血發(fā)病機制的一個合理方向。本研究擬通過建立谷氨酸誘導(dǎo)損傷的神經(jīng)細胞損傷模型，探討燈盞細辛合尼莫地平合用對神經(jīng)元的保護作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 1）細胞株：高分化PC12細胞購自中國科學(xué)院昆明細胞庫。2）藥物與試劑：燈盞細辛注射液，云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，批號20130436。尼莫地平注射液，青島金峰制藥有限公司，批號13101101。高糖DMEM培養(yǎng)基（H-DMEM），Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清，海克隆公司產(chǎn)品。谷氨酸（Glu）：Amresco公司產(chǎn)品。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒：由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。完全培養(yǎng)液：含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素的HDMEM培養(yǎng)液。燈盞細辛培養(yǎng)液和尼莫地平培養(yǎng)液分別用不含胎牛血清的完全培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度。3）主要儀器：MCO175型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱 （日本SANYO公司產(chǎn)品）；倒置顯微鏡（日本Olympus產(chǎn)品）；流式細胞儀（型號為CYTOMICS FC500，日本BECKMAN COULTER產(chǎn)品）。

1.2 PC12細胞的培養(yǎng) PC12細胞用完全培養(yǎng)基在37℃，5%CO2，飽和濕度的條件下培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.3 Glu誘導(dǎo)PC12細胞損傷模型的建立 將處于對數(shù)生長期的細胞按1×104個細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，待細胞完全融合后，磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕蕩洗兩遍，加入含Glu無胎牛血清完全培養(yǎng)液，使Glu終濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10、20、30、50 mmol/L，每個劑量設(shè)3個平行孔，同時設(shè)未加藥物的無血清培養(yǎng)液組作對照，在加藥培養(yǎng)后的16 h時，以MTT法測定其增殖情況。

1.4 燈盞細辛對Glu誘導(dǎo)PC12細胞增殖的影響 將處于對數(shù)生長期的細胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細胞完全融合后，隨機分組，每組設(shè)3個平行孔，其中空白對照組和誘導(dǎo)損傷液組換用無血清完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，燈盞細辛培養(yǎng)液組，加入終濃度分別為原液、1/4原液、1/16原液、1/64原液的燈盞細辛培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h，然后除空白對照組外，其余各組均換用含上述篩選濃度的Glu誘導(dǎo)損傷液繼續(xù)培養(yǎng)16 h，以MTT法測定其增殖情況。

1.5 尼莫地平對Glu誘導(dǎo)損傷PC12細胞凋亡的影響取出接種24孔培養(yǎng)板且鋪滿單層的PC12細胞，棄原培養(yǎng)基，用PBS蕩洗1次，隨機分為8組，每組設(shè)3個平行孔，其中空白對照組和誘導(dǎo)損傷液組換用無血清完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，尼莫地平培養(yǎng)液組加入終濃度分別為20、10、5 μmol/L尼莫地平培養(yǎng)液，分別作用2 h和4 h，除空白對照組外，其余各組均換用含上述篩選濃度的Glu誘導(dǎo)損傷液繼續(xù)培養(yǎng)16 h，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，0.25%胰酶消化，完全培養(yǎng)液終止，1000 r/min離心5 min，棄上清，按照Annexin V-FITC試劑盒說明操作，上流式細胞儀分析各組細胞凋亡情況。

1.6 燈盞細辛與尼莫地平合用對Glu誘導(dǎo)損傷PC12細胞凋亡影響 取出接種24孔培養(yǎng)板且鋪滿單層的PC12細胞，棄原培養(yǎng)基，用PBS蕩洗1次，隨機分為8組，每組設(shè)3個平行孔，其中空白對照組和誘導(dǎo)損傷液組換用無血清完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，燈盞細辛與尼莫地平合用組，分別加入含燈盞細辛（通過以上實驗篩選出的燈盞細辛最佳劑量組）與尼莫地平高、中、低藥液的無血清完全培養(yǎng)液，其中3組先加燈盞細辛培養(yǎng)液作用2 h后，再加入不同劑量的尼莫地平培養(yǎng)液再共同作用2 h；另3組為燈盞細辛與不同劑量的尼莫地平培養(yǎng)液共同作用4 h后，除正常對照組外，其余各組均換用含上述篩選濃度的Glu誘導(dǎo)損傷液繼續(xù)培養(yǎng)16 h，處理同前，上流式細胞儀分析各組細胞凋亡情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Glu誘導(dǎo)PC12細胞損傷模型的建立 見表1。含0.1～5 mmol/L Glu對PC12細胞增殖無明顯影響，而10～50 mmol/L Glu對PC12細胞增殖有明顯抑制作用，因此，本研究擬選用10 mmol/L Glu作為造模濃度。

表1 各組PC12細胞增殖的比較（±s）

表1 各組PC12細胞增殖的比較（±s）

與空白對照組比較，△P＜0.01。

組 別 n 劑量（m m o l / L） 細胞增殖（A 5 7 0 n m）空白對照組 3 — 2 . 5 6 ± 0 . 1 3 G l u誘導(dǎo)損傷組 3 0 . 1 2 . 4 5 ± 0 . 0 5 3 0 . 5 2 . 5 0 ± 0 . 0 8 3 1 . 0 2 . 4 0 ± 0 . 0 5 3 5 . 0 2 . 4 0 ± 0 . 0 7 3 1 0 . 0 2 . 1 5 ± 0 . 1 9△3 2 0 . 0 1 . 5 0 ± 0 . 1 3△3 3 0 . 0 0 . 7 4 ± 0 . 0 6△3 5 0 . 0 0 . 0 5 ± 0 . 0 1△

2.2 燈盞細辛對Glu誘導(dǎo)PC12細胞增殖的影響 見表2。燈盞細辛1/4原液，1/16原液組能明顯促進Glu損傷的PC12細胞增殖，與誘導(dǎo)損傷組比較有顯著差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；原液組和1/64原液組與誘導(dǎo)損傷組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組Glu損傷PC12細胞增殖的比較（±s）

表2 各組Glu損傷PC12細胞增殖的比較（±s）

與誘導(dǎo)損傷組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n 劑量（m m o l / L） 細胞增殖（A 5 7 0 n m）空白對照組 3 — 2 . 5 6 ± 0 . 1 3 G l u誘導(dǎo)損傷組 3 — 2 . 1 5 ± 0 . 1 9燈盞細辛組 3 原液 2 . 2 2 ± 1 . 9 5△△3 1 / 4原液 2 . 4 9 ± 0 . 1 0**3 1 / 1 6原液 2 . 6 9 ± 0 . 0 8**3 1 / 6 4原液 2 . 2 8 ± 0 . 1 3△

表3 各組Glu損傷PC12細胞凋亡的比較（±s）

表3 各組Glu損傷PC12細胞凋亡的比較（±s）

組 別 n 劑量（m m o l / L） 細胞凋亡率空白對照組 3 — 1 4 . 2 3 ± 4 . 3 5 G l u誘導(dǎo)損傷組 3 — 1 . 0 7 ± 0 . 1 5尼莫地平2 h組 3 2 0 2 . 4 3 ± 0 . 5 1**3 1 0 7 . 8 0 ± 1 . 9 1*△△3 5 1 2 . 1 7 ± 6 . 2 8△△尼莫地平4 h組 3 2 0 1 . 5 7 ± 0 . 6 4**3 1 0 1 . 1 6 ± 0 . 5 9**3 5 3 . 7 0 ± 1 . 3 5**

2.3 尼莫地平對Glu誘導(dǎo)損傷PC12細胞凋亡的影響見表3。尼莫地平20 mol/L濃度組作用2 h，尼莫地平3個濃度組作用4 h，均能明顯抑制Glu誘導(dǎo)損傷的PC12細胞凋亡，與誘導(dǎo)損傷組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），提示尼莫地平對Glu誘導(dǎo)損傷PC12細胞凋亡的抑制作用成時間和劑量依賴性，劑量越大，作用時間越長，效果越明顯。

2.4 燈盞細辛與尼莫地平合用對Glu誘導(dǎo)損傷PC12細胞凋亡影響 見表4。燈盞細辛原液/4與尼莫地平3個濃度組合用，無論作用2 h還是4 h，均能明顯抑制Glu誘導(dǎo)損傷的PC12細胞凋亡，與誘導(dǎo)損傷組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），提示燈盞細辛可以增強尼莫地平的神經(jīng)細胞保護作用。

表4 各組Glu損傷PC12細胞凋亡的比較（±s）

表4 各組Glu損傷PC12細胞凋亡的比較（±s）

組 別 n 劑量（m m o l / L） 細胞凋亡率空白對照組 3 — 1 4 . 2 3 ± 4 . 3 5 G l u誘導(dǎo)損傷組 3 — 1 . 0 7 ± 0 . 1 5燈盞細辛合 3 2 0 2 . 0 7 ± 0 . 9 5**尼莫地平2 h組 3 1 0 4 . 6 7 ± 1 . 0 1**△3 5 6 . 5 7 ± 2 . 6 8**△△燈盞細辛合 3 2 0 1 . 4 7 ± 0 . 5 5**尼莫地平4 h組 1 0 1 0 0 . 3 0 ± 0 . 5 2**3 5 2 . 9 3 ± 0 . 8 4**

3 討 論

腦缺血是一個復(fù)雜的病理級聯(lián)反應(yīng)機制，其核心問題是神經(jīng)元損害引起的神經(jīng)功能障礙，腦缺血后神經(jīng)細胞并不會立即死亡，而是神經(jīng)細胞的凋亡［2］是一漸進的過程，這就為神經(jīng)保護治療帶來了機會［3］。

目前，雖然神經(jīng)保護劑的研究取得了長足進步，但是幾乎所有的神經(jīng)保護劑臨床均無效或效果很差，或因嚴重副作用，限制了臨床應(yīng)用［4］，因此，進一步研究新的神經(jīng)保護劑或?qū)で笮碌纳窠?jīng)保護方法成為研究的重點。缺血性腦卒中級聯(lián)損傷的“瀑布反應(yīng)”是非線性和循環(huán)的，采用作用機制多樣的神經(jīng)保護劑，或聯(lián)合作用于級聯(lián)反應(yīng)不同環(huán)節(jié)的幾種神經(jīng)保護劑，即神經(jīng)保護劑雞尾酒療法［5］也得到越來越多的關(guān)注。尼莫地平是二氫吡啶類（DHPs）鈣離子拮抗劑，具有脂溶性，易于穿透血腦屏障（blood-brain barrier），并具有選擇性擴張腦血管作用及神經(jīng)和精神藥理活性，實驗證實尼莫地平具有明顯的細胞保護效應(yīng)［6］，但由于其選擇性不高、系統(tǒng)性血壓降低等副作用，限制了其臨床應(yīng)用。

燈盞細辛來源于菊科飛蓬屬植物短草飛蓬，始載于《滇南本草》，其記載有“左癱右瘓，水煎點水酒服”。研究顯示［7-9］，燈盞細辛能改善腦缺血患者的腦血液循環(huán)，減輕腦組織缺血性損傷，增加腦血流量，使梗死灶的血供恢復(fù)；而申亮等［10］研究顯示燈盞細辛具有較強的清除自由基作用；張靜等［11］研究顯示，燈盞細辛能促進大鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞的存活而達到腦保護的作用；大量現(xiàn)代藥理研究均證實，它能擴張微細血管改善微循環(huán)，降低血液黏稠度，清除氧自由基，抗炎、對抗脂質(zhì)過氧化及缺血再灌注等廣泛的藥理作用。而其與尼莫地平合用對腦缺血患者的腦保護作用，研究甚少。

本研究結(jié)果顯示，燈盞細辛1/4原液、1/16原液組對體外建立的神經(jīng)細胞損傷模型具有明顯的保護作用，尼莫地平單藥對體外建立的神經(jīng)細胞損傷模型也具有保護作用，且成時間和劑量依賴性，劑量越大，作用時間越長，效果越明顯。將燈盞細辛與尼莫地平合用，探討其共作用對體外建立的神經(jīng)細胞損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，燈盞細辛可以增強尼莫地平的神經(jīng)細胞保護作用，能有效減少和降低尼莫地平的用量和作用時間，達到神經(jīng)細胞保護作用。這也表明雞尾酒療法有助于神經(jīng)細胞的保護性治療，也進一步提示我們臨床上二藥合用，有助于缺血性腦卒中的治療，但是二者合用的作用機制，有待于進一步探索。

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Objective：To investigate the effects of Erigeron breviscapus and nimodipine on neurons apoptosis of PC12 cell induced by glutamate.Methods：PC12 cells were cultured，using glutamate to intervention，then with flow cytometry to detect the effects of apoptosis by Erigeron breviscapus and nimodipine.Results：10，20 μmol/L dose group in 2 h and three dose group in 4 h of Nimodipine can inhibit the apoptosis of PC12 cells obviously. Erigeron breviscapus and nimodipine with different dose in 2 h and 4 h can inhibit the apoptosis of PC12 cells obviously.Conclusion：Nimodipine can inhibit the apoptosis of PC12 cells on time and is dose dependent. Erigeron breviscapus and nimodipine can inhibit the apoptosis of PC12 cells obviously.Erigeron breviscapus can induce the time and dose of nimodipine.

Erigeron breviscapus；Nimodipine；Glutamate；Neurons apoptosis

R285.6

A

1004-745X（2015）08-1367-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.08.020

2015-02-18）

廣東省佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項目（No.201308179）

To Investigate the Protective Effects of Erigeron Breviscapus and Nimodipine on Neurons Damage In-duced by Glutamate

LIU Xinying，WU Zuqiang，LI Rong，et al. Luocun Hospital of Nanhai Foshan，Guangdong，F(xiàn)oshan 528226，China