趙 旭， 肖舒心， 郭蓓寧

·論著·

不同免疫抑制狀態(tài)小鼠鮑曼不動桿菌的致病性差異研究

趙 旭， 肖舒心， 郭蓓寧

目的構(gòu)建正常小鼠、輕度和重度免疫抑制小鼠鮑曼不動桿菌肺炎模型，研究不同免疫狀態(tài)下鮑曼不動桿菌的致病性。方法①分別構(gòu)建正常小鼠、輕度和重度免疫抑制小鼠鮑曼不動桿菌肺炎模型；②144只ICR雌性小鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常對照組（組1）、輕度免疫抑制組（組2）、重度免疫抑制組（組3）、感染組（組4）、輕度免疫抑制感染組（組5）及重度免疫抑制感染組（組6），每組24只小鼠。氣管插管后組1、組2、組3經(jīng)氣管插管注射生理鹽水10μL，組4、組5、組6注射鮑曼不動桿菌菌液（3.8×108CFU/mL）10μL；③分別于0、24、48、72、120和168 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)選取4只小鼠，進(jìn)行血白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、小鼠肺組織細(xì)菌計(jì)數(shù)，以及肺組織病理檢查。結(jié)果組6有5只小鼠死亡，病死率達(dá)到20.8%，余組無死亡。組4為免疫功能正常小鼠，感染鮑曼不動桿菌后2 d肺內(nèi)細(xì)菌全部被清除，白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在感染后1～3 d明顯上升，5～7 d后基本恢復(fù)正常水平，病理示一過性肺組織損傷包括局部肉芽腫形成及肺間質(zhì)損傷；組6為重度免疫缺陷小鼠，在感染后肺組織中的細(xì)菌量持續(xù)增長，第3天上升至感染初期的145倍，之后菌量減少。感染2 d內(nèi)白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞始終處于極低水平，3 d后逐漸恢復(fù)至正常水平，至第7天明顯升高至正常水平的2倍以上，組織病理示感染7 d后整葉肺呈實(shí)變、壞死，肺泡、支氣管及血管結(jié)構(gòu)均被破壞；組5與正常小鼠感染過程類似，細(xì)菌在第3天被完全清除。結(jié)論正常小鼠感染鮑曼不動桿菌后，肺內(nèi)細(xì)菌可以完全清除，但仍有一過性肺組織病理損傷；重度免疫抑制小鼠感染后細(xì)菌會在肺內(nèi)增殖，肺組織病理損傷隨時(shí)間延長明顯加重；機(jī)體不同免疫狀態(tài)可影響鮑曼不動桿菌感染的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。

鮑曼不動桿菌； 小鼠肺炎模型； 免疫抑制； 致病性

鮑曼不動桿菌屬不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界、醫(yī)院及人體皮膚，主要引起醫(yī)院獲得性肺炎，尤其是呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎，亦可引起血流感染、腦膜炎、腹膜炎、傷口感染等多種感染［1］。該菌是醫(yī)院感染最常見細(xì)菌之一，尤其是多重耐藥鮑曼不動桿菌（multidrug-resistantAcinetobacter baumanii），即同時(shí)對3種以上不同類型的抗菌藥物耐藥的鮑曼不動桿菌，甚至泛耐藥菌株（pan-drugresistantAcinetobacterbaumanii）不斷增多，常在重癥監(jiān)護(hù)病房、血液科病房等引起流行，導(dǎo)致治療困難，病死率高，臨床迫切需要新的有效治療方法［2］。鮑曼不動桿菌作為條件致病菌，致病力較弱。文獻(xiàn)報(bào)道免疫功能正常小鼠采用超聲霧化吸入法或微量氣管直接注射等方法肺部接種細(xì)菌，72 h后細(xì)菌均可被清除，無法形成肺部感染，只有采用大劑量免疫抑制劑或激素等破壞小鼠免疫系統(tǒng)才能形成肺炎［3-4］，提示機(jī)體免疫系統(tǒng)尤其是天然免疫在抵抗鮑曼不動桿菌感染中可能起重要作用［5］。為對鮑曼不動桿菌的致病性和免疫狀態(tài)進(jìn)行深入研究，課題組前期采用耳窺鏡直視下氣管插管法成功構(gòu)建了小鼠鮑曼不動桿菌肺炎模型［6］。本研究采用此模型研究在正常、輕度免疫抑制、重度免疫抑制等不同免疫狀態(tài)下鮑曼不動桿菌的致病性，以初步反映鮑曼不動桿菌的毒力，其感染機(jī)體后宿主的免疫反應(yīng)以及細(xì)菌引起肺部感染的病理過程，從而為進(jìn)一步研究鮑曼不動桿菌致病機(jī)制和與宿主免疫系統(tǒng)相互作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 鮑曼不動桿菌HS-1511為臨床分離菌株，2011年分離自上海華山醫(yī)院住院患者腦脊液標(biāo)本。微量稀釋法藥敏結(jié)果顯示該菌對臨床常用抗革蘭陰性桿菌藥物亞胺培南、頭孢哌酮-舒巴坦等均耐藥，僅對替加環(huán)素及多黏菌素敏感。

1.1.2 試劑 環(huán)磷酰胺，批號SLBC0666V，麻醉劑2，2，2-三溴乙醇，批號STBC1157V，均購自Sigma公司；LB Broth培養(yǎng)基，批號14012937G，LB Agar培養(yǎng)基，批號14012950G，均購自上海生工公司；生理鹽水，批號WFI21110，旭東海普制藥公司生產(chǎn)；甲醛組織固定劑，批號20131022，中山市康乃欣生物醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)；蘇木精-伊紅染色劑，批號120812，上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)。白細(xì)胞稀釋液，批號20110507，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物 ICR清潔級小鼠，鼠齡6周左右，體重20～25 g，雌性，合格證號；SCXK（滬）；2012-0002，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司。小鼠飼養(yǎng)溫度18～25℃，相對濕度50%～70%，本實(shí)驗(yàn)使用小鼠144只。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)器材和儀器 小鼠氣管插管工具盒，美國Braintree公司產(chǎn)品，型號為RW-A3747，包括電池手柄、耳鏡頭、3.5 mm耳窺鏡、門齒環(huán)、小鼠氣管內(nèi)導(dǎo)管、喉鏡；一次性氣管插管（采用BD公司1.1 mm×30 mm一次性使用靜脈留置針）；嚙齒動物工作臺，美國Braintree公司產(chǎn)品，型號RWA3467；搖床，美國New Brunswick科技公司生產(chǎn)，型號innova 4200；分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司生產(chǎn)，型號XS205；紫外可見光分光光度計(jì)，美國UNIC公司產(chǎn)品，型號UV-2102C型；組織勻漿機(jī)，法國Bertin公司precellys 24多功能生物樣品均質(zhì)器；電子顯微鏡，日本Nikon公司E2000電子顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 小鼠鮑曼不動桿菌肺炎模型的建立 采用耳窺鏡直視下氣管插管法構(gòu)建小鼠鮑曼不動桿菌肺炎模型［6］。具體方法簡要描述如下。

1.2.1.1 誘導(dǎo)小鼠免疫抑制 在實(shí)驗(yàn)前4 d和前1 d分別采用腹腔注射50 mg/kg和50 mg/kg、200 mg/kg和150 mg/kg環(huán)磷酰胺分別誘導(dǎo)小鼠輕度或重度免疫抑制。

1.2.1.2 菌液制備 挑取LB平皿上生長的單個(gè)鮑曼不動桿菌菌落，置10 mL LB液體培養(yǎng)基中于搖床中37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)2 h至A值0.1左右（600 nm），取5 mL細(xì)菌懸液4℃、4 000 r/min離心10 min，棄上清液后采用1 mL生理鹽水懸浮制備菌液，取100μL菌液經(jīng)系列稀釋后接種于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h后行菌落計(jì)數(shù)，菌液濃度約為2.0 ×108～5.0×108CFU/mL。

1.2.1.3 小鼠氣管插管及菌液注射 1.25%2，2，2-三溴乙醇（25 mg/kg）腹腔注射，待小鼠麻醉后仰臥位固定小鼠于嚙齒動物工作臺上，采用美國Braintree公司氣管插管工具盒行耳窺鏡直視下行小鼠氣管插管。氣管插管成功后，沿氣管插管注射10μL鮑曼不動桿菌菌液，吹打3次，確保菌液全部進(jìn)入小鼠肺部。

1.2.1.4 肺組織細(xì)菌定量 待麻醉小鼠全部蘇醒，頸椎脫臼法處死小鼠，無菌操作取出小鼠兩側(cè)肺，稱重后每0.1 g肺加入0.9 mL生理鹽水，組織勻漿機(jī)研磨，取混懸液100μL經(jīng)系列稀釋后接種于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h后行菌落計(jì)數(shù)，繼而計(jì)算出每克肺組織的細(xì)菌含量。

1.2.2 不同免疫抑制狀態(tài)小鼠鮑曼不動桿菌的致病性差異

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及設(shè)計(jì) 根據(jù)本課題組既往的研究結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)前4 d和前1 d分別腹腔注射環(huán)磷酰胺200 mg/kg和150 mg/kg后，第0天小鼠血液中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)下降約90%，為重度免疫抑制；注射50 mg/kg、50 mg/kg后，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)下降約20%，為輕度免疫抑制［7］。依據(jù)上述研究結(jié)果，將144只小鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常對照組（組1）、輕度免疫抑制組（組2）、重度免疫抑制組（組3）、感染組（組4）、輕度免疫抑制感染組（組5）和重度免疫抑制感染組（組6），每組均為24只小鼠。其中組2和組5在實(shí)驗(yàn)前4 d和前1 d分別采用環(huán)磷酰胺50 mg/kg和50 mg/kg腹腔注射后誘導(dǎo)輕度免疫缺陷；組3和組6在實(shí)驗(yàn)前4 d和前1 d分別采用環(huán)磷酰胺20 mg/kg和150 mg/kg腹腔注射后誘導(dǎo)重度免疫缺陷；組1和組4小鼠均不給予環(huán)磷酰胺，為免疫功能正常的小鼠。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)日（day 0）6組小鼠均按上述方法行氣管插管后，組1、組2、組3沿氣管插管注射10μL生理鹽水，組4、組5、組6沿插管注射10μL鮑曼不動桿菌菌液（3.8×108CFU/mL），以實(shí)驗(yàn)當(dāng)日最后一只小鼠蘇醒的時(shí)間記為0 h。

1.2.2.2 觀察指標(biāo) ①小鼠行為學(xué)觀察，觀察小鼠體型、進(jìn)食、活動、體毛、呼吸等變化情況；②血常規(guī)變化，分別于0、24、48、72、120和168 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)從各組小鼠中隨機(jī)選取4只，從眼眶后靜脈叢取血，作血涂片并吸取20μL置于380μL白細(xì)胞稀釋液中行血常規(guī)分析，觀察白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等計(jì)數(shù)；③肺組織細(xì)菌計(jì)數(shù)和病理檢查；每組小鼠分別在上述取血同時(shí)間采用頸椎脫臼法處死4只，其中3只采用無菌操作取出小鼠兩肺稱重后作組織勻漿并行細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)算每克肺組織中的細(xì)菌含量。余1只處死后取出肺組織采用4%甲醛液固定，石蠟包埋、病理切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，用顯微鏡觀察肺組織的炎性反應(yīng)和病理改變。若出現(xiàn)自然死亡即刻解剖取出肺組織固定后進(jìn)行病理切片檢查。

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為學(xué)觀察及死亡率

6 組小鼠均觀察至7 d，其中組1進(jìn)食、活動無明顯異常。組2和組3小鼠在0～72 h內(nèi)飲食及活動減少、體重增加緩慢，但在120 h和168 h一般情況較前好轉(zhuǎn)，組2和組3小鼠無死亡。組4、組5、組6均為鮑曼不動桿菌感染小鼠，感染后出現(xiàn)不同程度呼吸急促、毛發(fā)豎立、飲食及活動減少、反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)，以組6癥狀最為嚴(yán)重，出現(xiàn)了蜷縮、顫抖及體重明顯減輕等表現(xiàn)，在48 h有2只死亡，72 h有3只死亡，死亡率達(dá)到20.8%。組4和組5癥狀較組6為輕，主要表現(xiàn)為小鼠嗜睡及毛發(fā)豎立，均無小鼠死亡。組4、組5、組6小鼠均以48～72 h癥狀最為嚴(yán)重，在120 h和168 h情況有所好轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為運(yùn)動較前增多，體重有所增加。

2.2 小鼠外周血中白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

6 組小鼠外周血中白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞平均計(jì)數(shù)見表1，平均計(jì)數(shù)隨時(shí)間變化的趨勢見圖1、2。其中組1作為組4的對照組，組2作為組5的對照組，組3作為組6的對照組。與組1比較，組4小鼠24 ～72 h白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高，均上升1.7倍左右（P＜0.01），但在120 h和168 h，組1和組4兩組白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)相似，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。顯示免疫功能正常小鼠肺部感染鮑曼不動桿菌后血液中白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在感染后24～72 h會明顯上升，但在感染后120～168 h基本恢復(fù)正常水平；圖1、2也顯示組4小鼠白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)先升后回落至基線水平的變化趨勢。組3和組6比較，從0至48 h，兩組小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)始終處于＜1.0×109/L、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)始終處于＜0.1×109/L這一極低水平（中性粒細(xì)胞減少達(dá)97%以上），72 h后兩組小鼠白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)逐漸上升，組3小鼠于感染后168 h恢復(fù)正常水平，組6小鼠在感染后168 h白細(xì)胞（13.8×109/L）及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（8.99×109/L）較組3及其他組小鼠明顯升高，達(dá)2倍以上，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。圖1、2顯示組3小鼠在接受大劑量免疫抑制劑后白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在0～48 h處于極低水平，自72 h開始上升，至168 h時(shí)基本恢復(fù)正常值；組6小鼠白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在0～72 h處于極低水平，在120和168 h明顯上升，至168 h時(shí)白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)驟然上升達(dá)到正常小鼠2倍以上，甚至超過感染組小鼠。提示這兩組小鼠白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞水平受免疫抑制劑環(huán)磷酰胺影響較大，但在72 h后環(huán)磷酰胺對小鼠血液系統(tǒng)免疫抑制作用減弱，故組3小鼠白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)上升至正常，組6小鼠因肺部感染鮑曼不動桿菌故在感染120～168 h后白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)水平均較正常小鼠明顯上升，提示小鼠肺部感染仍持續(xù)存在且較嚴(yán)重。組2和組5兩組小鼠白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞水平介于正常小鼠和重度免疫抑制小鼠之間，在0～48 h小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)較正常小鼠降低50%以上，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較正常小鼠降低80%以上，72 h后小鼠白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞基本恢復(fù)正常水平，考慮也與72 h后環(huán)磷酰胺對小鼠血液系統(tǒng)免疫抑制作用減弱有關(guān)，兩組小鼠各時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)相似。圖1、2也顯示組2和組5兩組小鼠白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在0～72 h處于較低水平，自120 h開始上升，168 h基本恢復(fù)正常水平。

表1 不同免疫狀態(tài)小鼠感染鮑曼不動桿菌后外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)Table1 The peripheral white blood cell（WBC）and neutrophils count in mice under different immune conditions after challenge with A.baumannii inoculation

圖1 不同免疫狀態(tài)小鼠感染鮑曼不動桿菌后外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化曲線Figure 1 The curves of peripheral white blood cell count over time in mice under different immune conditions after inoculation of A.baumanniisuspension

圖2 不同免疫狀態(tài)小鼠感染鮑曼不動桿菌后外周血中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化曲線Figure 2 The curves of peripheral neutrophils count over time in mice under different immune conditions after inoculation of A.baumanniisuspension

2.3 小鼠肺組織細(xì)菌定量

組1、組2和組3小鼠肺內(nèi)注射的為生理鹽水，故各時(shí)間點(diǎn)肺組織細(xì)菌量均為0。組4、組5及組6小鼠感染鮑曼不動桿菌后168 h內(nèi)不同觀察點(diǎn)肺組織平均細(xì)菌量見表2。可見組4正常小鼠感染鮑曼不動桿菌后24 h肺內(nèi)細(xì)菌量減少為原來1/1 000，至48 h后3只小鼠肺內(nèi)細(xì)菌全部被清除，細(xì)菌計(jì)數(shù)為0，之后72 h直到感染后168 h小鼠肺內(nèi)無細(xì)菌再生長。而組6為重度免疫缺陷小鼠，在感染后24 h肺內(nèi)菌落計(jì)數(shù)就上升至感染初期的22倍，此后肺組織中的細(xì)菌量持續(xù)增長，至72 h上升至感染初期的145倍，達(dá)到最高值（7.69×109CFU/g肺組織）；但感染120 h后，隨著環(huán)磷酰胺對血液系統(tǒng)骨髓抑制作用的減弱，小鼠中性粒細(xì)胞水平上升，細(xì)菌被部分清除，表現(xiàn)為肺內(nèi)細(xì)菌量有所減少，至感染后168 h小鼠肺內(nèi)細(xì)菌量最少，降至最高峰的1/200，接近0 h水平。組5為輕度免疫缺陷小鼠，與正常小鼠感染鮑曼不動桿菌過程類似，24 h肺內(nèi)細(xì)菌量減少為原來的1/1 000，至48 h發(fā)現(xiàn)3只小鼠中僅有1只小鼠肺內(nèi)存在細(xì)菌，其細(xì)菌計(jì)數(shù)為1.40×103CFU/g肺組織，減少為最初接種細(xì)菌量的1/104，至72 h細(xì)菌全部被清除，之后直到感染后168 h小鼠肺內(nèi)再無細(xì)菌生長，另2只小鼠肺組織未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長。

2.4 小鼠感染后肺病理結(jié)果

正常小鼠感染后24～48 h肺組織表現(xiàn)為肺間質(zhì)充血、水腫，肺泡間隔和部分肺泡腔內(nèi)見大量單核和淋巴細(xì)胞及散在中性粒細(xì)胞浸潤，在肺組織內(nèi)有肉芽腫結(jié)構(gòu)形成，同時(shí)合并有肺組織和肺間質(zhì)炎性反應(yīng)表現(xiàn)；72 h后隨著肺內(nèi)細(xì)菌的清除，肺組織病理表現(xiàn)為肺間質(zhì)炎性反應(yīng)減輕，感染后168 h肺組織病理表現(xiàn)基本恢復(fù)正常，但肺間質(zhì)炎癥仍持續(xù)存在，典型病理見圖3A～3C。

表2 不同免疫狀態(tài)小鼠感染鮑曼不動桿菌后肺組織菌落計(jì)數(shù)變化Table2 Pulmonary colony-forming unit（CFU）of bacteria in mice under different immune conditions after inoculation of A.baumannii suspension （mean±SD）

重度免疫抑制小鼠感染即刻（0 h），肺組織基本正常，肺泡腔開放，肺泡壁無增厚，壁內(nèi)未見炎性細(xì)胞等浸潤，有小灶性出血；24～48 h肺泡壁毛細(xì)血管充血明顯，片狀的肺泡腔內(nèi)可見藍(lán)紫色顆粒狀的滲出物，但炎性細(xì)胞浸潤不明顯；72 h肺泡壁毛細(xì)血管充血、出血明顯，大片狀的肺泡腔內(nèi)可見藍(lán)紫色顆粒狀的滲出物及滲出的水腫液，少量炎性細(xì)胞浸潤，以單核巨噬細(xì)胞為主，并伴少量中性粒細(xì)胞浸潤；168 h整葉肺呈實(shí)變、壞死，肺泡、支氣管及血管結(jié)構(gòu)均被破壞，局部肺組織可見明顯出血，高倍鏡下見壞死區(qū)域內(nèi)大量中性粒細(xì)胞和膿細(xì)胞浸潤，典型病理見圖3D～3F。

輕度免疫抑制小鼠感染后48 h病理示大片肺泡間隔和部分肺泡腔內(nèi)見大量單核和淋巴細(xì)胞及散在中性粒細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)充血；72 h肺間質(zhì)充血減輕，但仍可見大片肺泡間隔內(nèi)有多量炎性細(xì)胞浸潤；168 h圍繞支氣管壁的肺組織內(nèi)可見局灶性肉芽腫，中央可見多核巨細(xì)胞，并伴有單核巨噬細(xì)胞浸潤、增生，部分支氣管結(jié)構(gòu)破壞，部分支氣管壁顯著增厚，周圍肺組織肺泡壁增厚，可見單核巨噬細(xì)胞浸潤，典型病理見圖3G～3I。

圖3 不同免疫狀態(tài)小鼠感染鮑曼不動桿菌后肺組織病理表現(xiàn)Figure 3 The pathologic findings in three groups of mice with different immune conditions after inoculation of A.baumanniisuspension

3 討論

鮑曼不動桿菌目前已經(jīng)成為醫(yī)院感染重要的致病菌。根據(jù)2012年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測顯示，不動桿菌屬（其中89.6%為鮑曼不動桿菌）檢出率在革蘭陰性桿菌中位居第3，僅次于大腸埃希菌和克雷伯菌屬［8］。隨著廣譜抗菌藥物，特別是碳青霉烯類在臨床上的廣泛應(yīng)用，鮑曼不動桿菌耐藥性不斷增強(qiáng)，多重耐藥和泛耐藥鮑曼不動桿菌不斷增多，給臨床治療帶來極大的困難。泛耐藥鮑曼不動桿菌引起的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎由于缺乏有效藥物治療，且感染此菌的患者絕大部分為終末期患者，免疫力低下，病死率更高，可達(dá)40%～70%［9］，故目前對鮑曼不動桿菌致病性及耐藥性研究已經(jīng)成為全球抗感染領(lǐng)域的關(guān)注焦點(diǎn)。

既往許多研究報(bào)道鮑曼不動桿菌系條件致病菌，在小鼠免疫力正常情況下可不致病，構(gòu)建小鼠鮑曼不動桿菌感染模型常需要采用免疫抑制劑或激素造成免疫抑制狀態(tài)才能使小鼠感染。本研究通過不同劑量的免疫抑制劑誘導(dǎo)小鼠不同程度的免疫抑制，以此來研究免疫機(jī)制在鮑曼不動桿菌所致肺炎中的作用。

本研究結(jié)果與既往研究（僅觀察至24 h）結(jié)果相似［7］，顯示正常小鼠鮑曼不動桿菌肺部感染程度較輕，24 h肺內(nèi)細(xì)菌量減少了近3個(gè)Log值，48 h后所有小鼠肺內(nèi)細(xì)菌全部被清除，之后直到感染后168 h小鼠肺內(nèi)再無細(xì)菌生長。雖然鮑曼不動桿菌在正常小鼠肺組織中經(jīng)48 h即被全部清除，但機(jī)體的免疫反應(yīng)仍對肺組織產(chǎn)生一定損傷；正常小鼠感染后24～48 h肺組織表現(xiàn)為肺間質(zhì)充血水腫，肺泡間隔和部分肺泡腔內(nèi)見大量單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞以及散在中性粒細(xì)胞浸潤，在肺組織內(nèi)有肉芽腫結(jié)構(gòu)形成，同時(shí)合并有肺組織和肺間質(zhì)炎性表現(xiàn)，72 h后隨著肺內(nèi)細(xì)菌的清除，肺組織病理表現(xiàn)為肺間質(zhì)炎性反應(yīng)減輕，感染后168 h肺組織病理表現(xiàn)基本恢復(fù)正常，但值得注意的是肺間質(zhì)炎性反應(yīng)仍持續(xù)存在。正常小鼠外周血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)也有相似表現(xiàn)，感染后24～72 h小鼠白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯上升，但在感染后120～168 h白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)水平基本恢復(fù)正常。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道目前考慮在鮑曼不動桿菌引起的感染中，天然免疫特別是中性粒細(xì)胞起重要作用［10］。鮑曼不動桿菌侵入機(jī)體后，血液中的中性粒細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)立即識別病原菌，并啟動Toll樣受體等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起局部感染部位中性粒細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞聚集，并釋放細(xì)胞因子及趨化因子，吞噬并殺滅細(xì)菌［11］。本次動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了這一假設(shè)；正常免疫功能小鼠感染鮑曼不動桿菌后，天然免疫立即啟動，在48 h內(nèi)就完全清除了細(xì)菌，但局部的免疫炎性反應(yīng)也造成了肺組織一定的損傷，病理表現(xiàn)為小鼠肺組織內(nèi)肉芽腫形成及肺間質(zhì)炎性反應(yīng)，這可能也與免疫反應(yīng)過度表達(dá)有關(guān)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示正常人肺部感染鮑曼不動桿菌后，可能也會發(fā)生一過性白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞升高，在組織水平產(chǎn)生肺組織一過性損傷，包括局部肉芽腫形成和肺間質(zhì)損傷，而此肺間質(zhì)損傷持續(xù)時(shí)間至少1周左右，即鮑曼不動桿菌感染后人體可能無臨床相關(guān)癥狀、體征，但在組織病理水平可能仍對機(jī)體造成一過性傷害。

重度免疫缺陷小鼠，由于大劑量環(huán)磷酰胺骨髓抑制作用，白細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞水平嚴(yán)重降低（降低97%），機(jī)體無法在感染后有效抑制肺內(nèi)細(xì)菌生長，導(dǎo)致細(xì)菌持續(xù)生長，72 h肺內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)上升至145倍，達(dá)到最高值，但到感染120 h后，隨著環(huán)磷酰胺對血液系統(tǒng)骨髓抑制作用的減弱，小鼠血液中性粒細(xì)胞水平上升，細(xì)菌被部分清除，表現(xiàn)為肺內(nèi)細(xì)菌量有所減少，至感染后168 h小鼠肺內(nèi)細(xì)菌量降低至最高峰的1/200，為感染初期的水平。肺組織病理表現(xiàn)為48～72 h肺泡壁毛細(xì)血管充血明顯，片狀的肺泡腔內(nèi)可見藍(lán)紫色顆粒狀的滲出物，少量炎性細(xì)胞浸潤，以單核巨噬細(xì)胞為主，并伴少量中性粒細(xì)胞浸潤，此時(shí)小鼠臨床表現(xiàn)最重，部分小鼠死亡。病理表現(xiàn)可能由于細(xì)菌感染直接造成肺泡毛細(xì)血管破裂，但由于小鼠重度免疫抑制狀態(tài)，中性粒細(xì)胞極度缺乏，故感染部位無法形成炎性細(xì)胞浸潤，無法吞噬感染的細(xì)菌，導(dǎo)致炎性反應(yīng)持續(xù)擴(kuò)散加重，未死亡小鼠肺組織炎性反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)展，至感染后168 h達(dá)到最嚴(yán)重狀態(tài)，肺泡內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞浸潤、增生，肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺組織實(shí)變。提示在環(huán)磷酰胺骨髓抑制作用消失后，一方面細(xì)菌的侵襲作用和毒素對肺組織結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，造成肺組織實(shí)變，另一方面中性粒細(xì)胞大量增加，局部吞噬細(xì)菌作用明顯增強(qiáng)，可能在殺滅細(xì)菌的同時(shí)免疫反應(yīng)過度表達(dá)，進(jìn)一步造成肺組織的病理損害。重度免疫缺陷組小鼠感染鮑曼不動桿菌后白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞變化也較大；小鼠白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在0～72 h處于極低水平，隨后逐漸升高，到168 h白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)驟然上升達(dá)到正常值2倍以上，超過感染組及其他組小鼠，提示在72 h后免疫抑制劑環(huán)磷酰胺作用消失［12］，其對骨髓的抑制作用緩解，由于肺部細(xì)菌感染持續(xù)存在，促使單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生粒細(xì)胞集落刺激因子等刺激骨髓粒細(xì)胞增生，釋放加快，使感染后168 h小鼠血中白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞數(shù)量大量增加。但本實(shí)驗(yàn)僅觀察到感染后168 h，重度免疫抑制小鼠肺部細(xì)菌和炎性反應(yīng)持續(xù)存在，隨后小鼠肺部感染是否痊愈還有待今后實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

輕度免疫缺陷小鼠，雖然感染初期其中性粒細(xì)胞水平較正常小鼠降低85%左右（0.2×109/L），但其感染過程卻與正常小鼠類似，在感染后72 h肺內(nèi)細(xì)菌已全部清除，且白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在120 h即恢復(fù)到正常水平，提示小鼠即使僅有15%的中性粒細(xì)胞，仍可保持強(qiáng)大吞噬功能清除造成機(jī)體感染的鮑曼不動桿菌，但直至感染后168 h肺組織局部仍有局灶性肉芽腫形成，表現(xiàn)為中央可見多核巨細(xì)胞，并伴有單核巨噬細(xì)胞浸潤、增生，另外局部支氣管結(jié)構(gòu)破壞，部分支氣管壁顯著增厚，周圍肺組織肺泡壁增厚，提示輕度免疫抑制小鼠肺內(nèi)感染鮑曼不動桿菌后，雖然72 h內(nèi)就完全清除了細(xì)菌，但局部的免疫炎性反應(yīng)造成了肺組織一定的病理損傷，其嚴(yán)重程度較正常小鼠為重，有支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)破壞，局灶性肉芽腫表現(xiàn)更為嚴(yán)重且持續(xù)時(shí)間也明顯延長，病理損傷持續(xù)至感染后168 h。

通過正常小鼠、輕度和重度免疫抑制小鼠感染鮑曼不動桿菌的肺部炎性反應(yīng)和病理結(jié)果比較，可得出以下結(jié)論；機(jī)體不同免疫狀態(tài)可影響鮑曼不動桿菌感染的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，機(jī)體在正常免疫情況下感染鮑曼不動桿菌可不致病，提示機(jī)體免疫機(jī)制對細(xì)菌有強(qiáng)大清除力、對輕度感染造成的組織損傷具有一定的修復(fù)作用，故提高機(jī)體免疫功能可能是治療鮑曼不動桿菌感染的新方法。

［1］ McConnell MJ，Actis L，Pachon J.Acinetobacterbaumannii；human infections，factors contributing to pathogenesis and animal models［J］.FEMS Microbiol Rev，2013，37（2）；130-155.

［2］ Garnacho-Montero J，Amaya-Villar R.MultiresistantAcinetobacterbaumanniiinfections；epidemiology and management［J］.Curr Opin Infect Dis，2010，23（4）；332-339.

［3］ Joly-Guillou ML，WoLff M，Poeidalo JJ，et al.Use of a new mouse model ofAcinetobacter baumanniipneumonia to evaluate the postantibiotic effect of imipenem［J］.Antimicrob Agents Chemother，1997，41（2）；345-351.

［4］ 余道軍，俞云松，方翔，等.亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌小鼠肺部感染模型建立［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，33（8）；771-775.

［5］ Mortensen BL，Skaar EP.Host-microbe interactions that shape the pathogenesis ofAcinetobacter baumanniiinfection［J］.Cell Microbiol，2012，14（9）；1336-1344.

［6］ 肖舒心，趙旭，郭蓓寧.采用耳窺鏡直視下氣管插管法構(gòu)建小鼠鮑曼不動桿菌肺炎模型［J］.中國感染與化療雜志，2015，15 （1）；51-56.

［7］ Guo B，Abdelraouf K，Ledesma KR，et al.Quantitative impact of neutrophils on bacterial clearance in a murine pneumonia model［J］.Antimicrob Agents Chemother，2011，55（10）；4601-4605.

［8］ 汪復(fù)，朱德妹，胡付品，等.2012年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測［J］.中國感染與化療雜志，2013，13（5）；321-330.

［9］ Garnacho J，Sole-Violan J，Sa-Borges M，et al.Clinical impact of pneumonia caused byAcinetobacter baumanniiin intubated patients；a matched cohort study［J］.Crit Care Med，2003，31（10）；2478-2482.

［10］ van Faassen H，KuoLee R，Harris G，et al.Neutrophils play an important role in host resistance to respiratory infection withAcinetobacter baumanniiin mice［J］.Infect Immun，2007，75（12）；5597-5608.

［11］ Knapp S，Wieland CW，F(xiàn)lorquin S，et al.Differential roles of CD14 and toll-like receptors 4 and 2 in murineAcinetobacter pneumonia［J］.Am J Respir Crit Care Med，2006，173（1）；122-129.

［12］ 趙弋清，羅霞，陳東輝，等.不同劑量環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)正常小鼠免疫抑制的對比研究［J］.免疫學(xué)雜志，2005，21（3）；s122-s124.

The pathogenesis of Acinetobacter baumannii in mice under different immune conditions

ZHAO Xu，XIAO Shuxin，GUO Beining.（Institute of Antibiotics，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics，Ministry of Health，Shanghai 200040，China）

；ObjectiveTo establishAcinetobacter baumanniipneumonia models in normal，mild immunodeficient and serious immunodeficient mice，and to examine the pathogenesis ofA.baumanniiunder different immune conditions.MethodsA.baumanniipneumonia models were established in normal，mild immunodeficient and serious immunodeficient mice，respectively.One hundred and forty-four mice were randomized into 6 groups including control（group 1），mild immunosuppression（group 2），serious immunosuppression（group 3），infection（group 4），infected after mild immunosuppression（group 5）and，infected after serious immunosuppression（group 6），24 mice in each group.After intubation，the mice in group 1，2 and 3 were given sterile saline，while those in groups 4，5，6 were inoculated with 10μL of freshA.baumanniisuspension（3.8×108CFU/mL）.Four mice were sacrificed at 0 h，24 h，48 h，72 h，120 h and 168 h，respectively in each group.Then blood sample and lung tissue were taken from each mouse aseptically for testing white blood cell（WBC）and neutrophils count，quantitative culture and histopathological analysis.ResultsFive（20.8%）mice were dead in group 6，while no mouse was dead in other 5 groups.After inoculation ofA.baumanniisuspension in group 4（normal）mice，pulmonary bacterial burden was eliminated over two days.The WBC and neutrophils count were obviously elevated over 1-3 daysafter infection，and returned to normal over 5-7 days.The histopathologic examination showed transient local granulomas and pulmonary interstitial injury.In group 6，the bacteria multiplied continuously in lungs of serious immunosuppressive mice，increased 145 times over 3 days and then decreased.The total WBC and neutrophils count were extremely low within first 2 days，increased since day 3，and continuously increased up to 2 times of the normal level on day 7.The histopathologic changes showed lung consolidation，necrosis and destruction of alveolus，bronchus and blood vessels.The infection process of mild immunosuppression mice（group 5）was similar to the normal mice（group 4）.The bacteria were eliminated from lungs on day 3.ConclusionsPulmonary bacteria could be eliminated completely in the mice with normal immunity.The pathologic changes showed transient lung injury.The pulmonary bacterial burden multiplied in serious immunosuppression mice accompanied by aggravation of pathologic lung injury.The status of immunity has impact on the development and outcome ofA.baumannii infection.

；Acinetobacter baumannii； pneumonia； animal model； immunodeficiency

R378.996

A

1009-7708（2015）02-0155-08

2014-07-15

2014-08-08

上海市科委實(shí)驗(yàn)動物研究專項(xiàng)基金（12140903203）。

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，衛(wèi)生部抗生素臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200040。

趙旭（1976—），男，主治醫(yī)師，主要從事細(xì)菌致病性和耐藥性研究。

郭蓓寧，E-mail；guobeining?aliyun.com。