李洪武

(鄭州航空工業(yè)管理學(xué)院體育部，河南鄭州 450015)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性、漸進性和退行性關(guān)節(jié)病變，以關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜炎癥為特征，引起關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，嚴重時需要進行全關(guān)節(jié)置換。OA是老年人最常見的關(guān)節(jié)疾病，在年齡超過50歲的人群中，OA在導(dǎo)致長期殘疾的疾病中僅次于心血管疾病，因此嚴重危害老年人的健康和生活質(zhì)量［1］。臨床實踐證實，運動療法對 OA具有顯著療效［2］，針對活動能力受限的OA患者，持續(xù)被動運動(continuous passive motion，CPM)方式可促進組織修復(fù)、恢復(fù)關(guān)節(jié)活動度、減輕疼痛、預(yù)防深靜脈血栓、縮短住院時間并減少開支［3，4］。目前的觀點認為:CPM最早可在OA患者術(shù)后麻醉尚未消退時進行［5］。但運動治療OA的具體機制仍不清楚。研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)和一氧化氮(nitric oxide，NO)在 OA 發(fā)病機制中起重要作用［6］，MMPs對軟骨細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)有極強的降解作用［7］，NO 由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化產(chǎn)生并介導(dǎo)軟骨ECM降解和軟骨細胞凋亡［8］。針對內(nèi)皮細胞的研究指出，NO可提高MMPs的表達和/或活性［9］，但OA發(fā)生時，軟骨組織內(nèi)NO對MMPs調(diào)控的機制尚不確定。動物實驗與臨床研究均表明，CPM對OA的療效與MMPs表達下調(diào)有關(guān)［10］，但CPM是否通過抑制NO信號途徑調(diào)控MMPs水平，尚不得而知。硝酸甘油(nitroglycerin，NG)在體內(nèi)代謝產(chǎn)生1，2－二硝基甘油和亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在線粒體內(nèi)進一步代謝生成NO，因此NG是NO的供體。本研究以雄性新西蘭大白兔為研究對象建立膝關(guān)節(jié)OA模型，觀察CPM和補充NG對軟骨細胞MMP－1和MMP－13表達以及NO含量的影響，探討CPM下調(diào)MMPs的可能機制。在眾多MMPs中，我們選取MMP－1和MMP－13是由于二者均屬于膠原酶亞型(降解軟骨ECM中含量最多的Ⅱ型膠原)且在OA中起關(guān)鍵作用［6，11］，而且其他 MMPs也是通過二者起作用的［7］。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實驗動物:純種雄性新西蘭大白兔30只，3～4月齡，體重2.8kg～4.2kg，由河南省實驗動物中心提供(實驗動物批號:20110302;許可證號:SCXK(豫)－2011－0001)。(2)藥物:2%NG軟膏，購自協(xié)和藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號:H20100195。(3)試劑:NO含量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR引物、MMP－1和MMP－13抗體、免疫組化試劑盒購自北京寶泰克生物科技有限公司;DAB顯色盒購自武漢博士德生物工程公司。其余試劑均為市售分析純。(4)儀器:CPM儀由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院提供;美國Beckman公司DU800型可見－紫外分光光度計;美國ABI公司7900 hT型實時熒光定量PCR儀。

1.2 模型制備

30只大白兔，取24只行單側(cè)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切斷術(shù)建立膝關(guān)節(jié)OA模型［12］。3%戊巴比妥鈉經(jīng)由耳緣靜脈麻醉動物后使其仰臥固定于兔臺上，于膝內(nèi)側(cè)切開關(guān)節(jié)囊，打開關(guān)節(jié)腔，將膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶切斷并切除內(nèi)側(cè)半月板。造模成功后，沖洗關(guān)節(jié)腔，逐層縫合。另取6只進行假手術(shù)，暴露內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)半月板，不做切斷而直接閉合關(guān)節(jié)腔。術(shù)后連續(xù)3d肌注青霉素20萬單位/次/d預(yù)防感染。在麻醉清醒后籠內(nèi)休息l天，術(shù)后第2天開始正式實驗。

1.3 干預(yù)分組

將6只假手術(shù)動物作為正常對照組(normal control group，NC組)。另外24只OA模型動物，術(shù)后隨機分為4組，每組各6只:(1)OA對照組(osteoarthritis control group，OA組):與NC組均不實施任何干預(yù)，籠中自由飼養(yǎng);(2)OA硝酸甘油給藥組(nitroglycerin group，NG組):于膝內(nèi)側(cè)切口無毛處，局部涂抹2%NG軟膏0.1mg，每天2次，共4周;(3)OA持續(xù)被動運動組(continuous passive motion group，CPM組):在CPM儀上進行膝關(guān)節(jié)持續(xù)被動運動(勻速運動，范圍為40°～110°)，每天早晚各一次，每次4h，共4周［13］;(4)OA持續(xù)被動運動+硝酸甘油給藥組(continuous passive motion+nitroglycerin group，CPM+NG組):運動方案同CPM組，給藥方案同NG組，共4周。

1.4 取材與組織切片制作

實驗結(jié)束后24h，空氣栓塞處死動物。按前次手術(shù)入路暴露股骨髁關(guān)節(jié)面，用高速電鉆鉆取軟骨標(biāo)本，分為三份。一份直接投入液氮，轉(zhuǎn)入﹣80℃低溫冰箱凍存待測NO含量以及MMP－1和MMP－13 mRNA表達;另外一份于4%多聚甲醛固定48 h后石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察軟骨形態(tài)學(xué)變化(軟骨表面是否規(guī)則、有無裂隙，細胞數(shù)量、分布、排列是否規(guī)則，潮線是否完整)并參考Mankin’s評分標(biāo)準(zhǔn)［14］對HE染色標(biāo)本進行評分比較;最后一份軟骨組織用多聚甲醛固定后，再用10%EDTA(乙二胺四乙酸)脫鈣10天，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，進行MMP－1和MMP－13免疫組化檢測。

1.5 NO含量測定

軟骨組織勻漿后，采用硝酸還原酶法測定NO含量，550nm波長處，0.5cm光徑測定吸光度值。計算公式為:NO含量(μmol/L)=(測定管吸光度值－空白管吸光度值)÷(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值－空白管吸光度值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度值×樣品測試前的稀釋倍數(shù)。

1.6 RQ－PCR檢測MMP－1和MMP－13 mRNA水平

取10mg軟骨組織勻漿后利用Trizol法(RNA提取試劑盒)抽提細胞總RNA，分光光度計檢測RNA質(zhì)量和濃度。取總RNA 3μg進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)得 cDNA。利用Primer 5.0設(shè)計上下游引物:MMP－1:上游:5’－AAGCCAGATGCTGAAACCCTG －3’，下 游:5’ － GACCCTTGGAGACTTTGGTGAAT－3’，擴增產(chǎn)物長度為328bp。MMP－13:上游:5’－TTGACCACTCCAAGGACCCAG －3’，下游:5’－GAGGATGCAGACGCCAGAAGA－3’，擴增產(chǎn)物長度252bp。內(nèi)參為GAPDH:上游:5’－GAGCTGAACGGGAAACTCAC －3’，下游:5’－GGTCTGGGATGGAAACTGTG －3’，擴增長度 476bp。將cDNA樣品配置于Real－time PCR 50μL反應(yīng)體系中:10×Buffer 5μL，dNTP 混合液 1μL，MgCl2 溶液 3μL，Taq 聚合酶2μL，上下游引物各 2μL，cDNA 為 2μL，三蒸水 33μL?；旌想x心后置于實時熒光定量PCR儀中進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min，40 個 PCR 循環(huán)(94℃，30s;55℃，40s;72℃，30 s)，最后72℃延伸5min。依據(jù)循環(huán)閾值(CT值)計算各基因的相對表達量(NC組的倍數(shù))。

1.7 免疫組化檢測MMP－1和MMP－13蛋白水平

石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，0.1%胰酶37℃水浴20min進行抗原修復(fù)，3%H2O2室溫浸泡10min滅活內(nèi)源性酶。滴加5%BSA封閉液，室溫封閉20min。加入稀釋的羊抗兔MMP－1和MMP－13抗體(一抗)，4℃孵育過夜，PBS緩沖液振洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，PBS緩沖液振洗3次，DAB顯色，鏡下控制顯色時間。脫水、透明，中性樹脂封片。

用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對軟骨組織中出現(xiàn)的棕褐色陽性產(chǎn)物的灰度進行分析，步驟為:在切片中隨機選取6個高倍鏡(10×40光鏡)不重疊視野作圖像分析，鏡下有棕褐色顆粒者為陽性細胞，測定陽性顆粒平均灰度值，取每張切片的均值作為MMP－1和MMP－13蛋白表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較使用單因素方差分析，LSD法進行兩兩比較。P＜0.05為顯著性水平，P＜0.01為非常顯著性水平。統(tǒng)計分析軟件為SPSS 14.0 for Windows。

2 結(jié)果

2.1 體重的變化

NC組體重在整個實驗過程中逐漸增加(P＜0.01);OA組和NG組體重在第15天開始下降并持續(xù)到實驗結(jié)束(P＜0.01)，可能與OA時關(guān)節(jié)疼痛導(dǎo)致的活動減少和飲食不足有關(guān);CPM組和CPM+NG組體重?zé)o顯著性變化(P＞0.05)。見圖1。

圖1 各組動物體重的變化

2.2 HE染色觀察

NC組為正常軟骨組織，表面平整光滑無破損，軟骨細胞核呈藍色、排列整齊，潮線清晰可見，基質(zhì)呈淡粉色，著色均勻;OA組關(guān)節(jié)軟骨表面呈網(wǎng)格狀硬化，軟骨細胞丟失，潮線紊亂甚至消失，纖維結(jié)締組織增生，基質(zhì)破壞明顯;NG組病理學(xué)變化較OA組更為明顯，軟骨細胞胞核、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)無法辨認，細胞廣泛丟失伴細胞壞死，基質(zhì)染色明顯不均并出現(xiàn)玻璃樣變性，;CPM組可見軟骨表面粗糙，細胞出現(xiàn)輕度變形或排列紊亂，細胞核固縮，潮線紊亂，基質(zhì)染色尚均勻，基質(zhì)變性較OA和NG組明顯減輕;CPM+NG組軟骨表面粗糙，有小的裂隙形成，細胞與基質(zhì)破壞較OA和NG組有所減輕，但仍較CPM組嚴重。見圖2。Mankin’s評分比較見表1。

圖2 HE染色(10×20)

表1 各組軟骨組織Mankin’s評分比較

2.3 NO含量

NC組NO含量低于其他各組(P＜0.01);NG組高于OA組(P＜0.01);CPM組低于OA組和NG組(P＜0.01);CPM+NG組低于NG組(P＜0.01)，但高于CPM組(P＜0.01)，與OA組無顯著性差異(P＞0.05)。見圖3。

圖3 各組NO含量的變化

2.4 MMP－1和MMP－13 mRNA變化

4周實驗結(jié)束后，與NC組比較，其他各組MMP－1和MMP－13 mRNA均顯著性升高(P＜0.01);NG組高于OA組(P＜0.01);CPM組高于低于OA組和NG組(P＜0.01);CPM+NG組低于NG組(P＜0.01)，高于CPM組(P＜0.01)，與OA組無顯著性差異(P＞0.05)。見圖4。

圖4 各組MMP－1和MMP－13 mRNA的變化

2.5 MMP－1和MMP－13蛋白的變化

NC組MMP－1和MMP－13均呈弱陽性表達，僅在表層軟骨細胞內(nèi)偶見少許棕褐色顆粒;OA組MMP－1和MMP－13呈強陽性表達，全層可見，軟骨基質(zhì)、胞漿中均有深棕褐色顆粒。NG組陽性細胞表達率較OA組明顯增多且染色深;CPM組可見陽性細胞表達，但其分布明顯較OA組和NG組分布稀疏，且染色較淺;CPM+NG組MMP－1、MMP－13均較OA組合NG組表達降低(P＜0.01)，但仍高于CPM組。見圖5和圖6?；叶戎捣秶?～255，灰度值越小，免疫染色程度越高，即蛋白表達量越多。結(jié)果顯示，MMP－1和MMP－13蛋白表達量與mRNA的變化趨勢基本一致，見表2。

圖5 MMP－1免疫組化(10×40)

圖6 MMP－13免疫組化(10×40)

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨中MMP－1和MMP－13染色平均灰度值

3 討論

3.1 MMPs和NO在OA發(fā)病機制中的作用

關(guān)節(jié)軟骨退變是OA最重要的標(biāo)志。關(guān)節(jié)軟骨屬透明軟骨，由軟骨細胞和軟骨ECM共同組成。軟骨ECM起著緩沖機械負荷和減小關(guān)節(jié)摩擦的作用，主要成分是水、膠原和蛋白聚糖，其中膠原以II型膠原為主(占膠原總量的90%左右)［7］。MMPs是降解ECM的主要酶系，是維持正常組織可塑性和完整性以及在病理狀態(tài)下(如OA)誘導(dǎo)軟骨退變的主要因子［7］，其中MMP－1和MMP－13可直接降解軟骨ECM中最具特征、含量最多的Ⅱ型膠原，其表達增高程度與軟骨組織破壞程度一致［6，11］，而且其他 MMPs亞型對Ⅱ型膠原的降解也需要通過MMP－1或MMP－13起作用［7］，因此兩者的變化最能反映軟骨基質(zhì)的代謝變化。在本研究中，NC組(即正常軟骨組織)MMP－1和MMP－13微量表達，以維持軟骨ECM的代謝穩(wěn)態(tài)與更新;而OA組MMP－1和MMP－13表達顯著上調(diào)，打破了ECM合成分解的動態(tài)平衡，降解作用增強，軟骨出現(xiàn)破壞，這與前人的研究一致［11］，進一步證實了MMPs在OA中的作用。

NO由NOS催化左旋精氨酸產(chǎn)生，可作為信號分子、神經(jīng)遞質(zhì)和免疫效應(yīng)分子在體內(nèi)多種生理病理過程中扮演關(guān)鍵角色。研究發(fā)現(xiàn)，正常軟骨組織中無NOS表達，而OA時軟骨細胞中NOS表達上調(diào)，NO合成增加［15］，同時OA患者關(guān)節(jié)滑液中NO含量升高，提示NO在OA中起關(guān)鍵作用。本研究證實了這一結(jié)論，即OA組NO含量顯著高于NC組。將NOS基因轉(zhuǎn)入軟骨細胞后發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞產(chǎn)生的大量NO可抑制軟骨基質(zhì)合成，促進膠原蛋白降解并誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡［8］。應(yīng)用iNOS抑制劑則能夠抑制NO的過量釋放，改善軟骨代謝環(huán)境，對軟骨有一定的保護作用［16］。本研究建立兔OA模型后，給予NG處理后，發(fā)現(xiàn)NG組關(guān)節(jié)軟骨退變明顯較OA組加重，與Cake等［17］對綿羊的研究結(jié)果相似，說明OA時NOS過表達催化NO大量合成，促進軟骨基質(zhì)降解。OA時發(fā)生炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激并產(chǎn)生眾多信號分子如白細胞介素 －1β(IL－1β)、腫瘤壞死因子 －α(TNF－α)和氧自由基(ROS)，上述因子通過作用于NOS基因啟動子序列進而激活NOS轉(zhuǎn)錄和翻譯［7］。

3.2 NO對MMP－1和MMP－13的調(diào)節(jié)作用

盡管對OA時內(nèi)源性NO抑制軟骨基質(zhì)合成作用較為肯定，但具體機制尚不明確。研究表明，多種組織中NO可上調(diào)MMPs，如在內(nèi)皮細胞中，外源性補充NO可誘導(dǎo)MMP－13表達升高，NOS失活后 MMP －13表達下調(diào)［18，19］，NO 可通過 cGMP－PKG信號途徑(轉(zhuǎn)錄水平)［18］以及對蛋白(酪氨酸殘基 －Tyr338)硝基化作用(翻譯后修飾)［20］調(diào)控 MMP－13基因表達;骨發(fā)育過程中，NO通過cGMP－PKG途徑磷酸化Cbfa－1，上調(diào)成骨細胞MMP－13表達，進而促進骨發(fā)生［21］;軟骨細胞培養(yǎng)證實，NO可上調(diào)MMP－2活性和表達量［22］，而NOS抑制劑則可下調(diào)MMP－1表達［23］。結(jié)合上述研究，我們推測，在OA中，NO對軟骨基質(zhì)的降解作用可能是通過上調(diào)MMPs表達實現(xiàn)的。本研究建立OA模型，于在體條件下直接證實了這一假設(shè)，即OA組MMP－1和MMP－13的mRNA和蛋白表達量顯著高于NC組，給予硝酸甘油處理后，其表達上調(diào)作用得到了加強，即NG組MMP－1和MMP－13的表達量顯著高于OA組，提示NO可通過上調(diào)MMPs表達發(fā)揮對OA的負性效應(yīng)。因此，NOS－NO－MMP－1/MMP－13是造成OA時ECM降解和病情進展的關(guān)鍵信號通路。

3.3 CPM通過抑制軟骨細胞NO合成下調(diào)MMP－1和MMP－13表達

傳統(tǒng)觀點認為:OA(特別是創(chuàng)傷性O(shè)A)患者需要較長時間制動，往往因肌肉萎縮、關(guān)節(jié)內(nèi)粘連等因素妨礙關(guān)節(jié)功能恢復(fù)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵硬、運動能力受限。如何促進受損關(guān)節(jié)軟骨的愈合與修復(fù)，是OA治療研究中的重點內(nèi)容。在目前常用的處理方法中，不管是制動、藥物治療、手術(shù)治療還是組織工程學(xué)等方法，均有其不足之處。20世紀(jì)70年代，Salter等［24］提出CPM理論，并將其應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨缺損后的修復(fù)過程，取得了令人滿意的效果，為臨床上防治OA的發(fā)生提供了新思路［3，4］。由于MMPs在OA發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用，因此推測CPM對OA的療效可能與MMPs下調(diào)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)過度使用(如長期超負荷運動)和廢用(如關(guān)節(jié)固定)均可上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨MMPs表達并造成軟骨組織降解，進而發(fā)生OA，而生理負荷強度運動(如日?；顒?則具有維持關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、預(yù)防軟骨降解和改善關(guān)節(jié)功能的作用［10］。Leong等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，中等強度被動運動可下調(diào)OA時軟骨細胞MMP－1表達。利用血流切應(yīng)力模擬運動負荷對體外培養(yǎng)的軟骨細胞實施干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，低切應(yīng)力(5dyn/cm2)使MMP－1和MMP－13表達稍有下調(diào)，而高切應(yīng)力(20 dyn/cm2)則使兩者表達顯著升高［25］。上述研究提示，運動對軟骨細胞MMPs表達的效應(yīng)具有運動強度依賴性。本研究采用的CPM方式，屬于典型的中低強度運動負荷［24］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPM 組 NO 含量、MMP－1和 MMP－13表達量雖然高于NC組，但均低于OA組，提示CPM通過抑制MMPs表達對OA起保護作用。

CPM是否通過抑制NO信號途徑調(diào)控MMPs水平是本研究的主要目的，以期為臨床OA患者治療方案的制定(運動聯(lián)合藥物)提供理論依據(jù)，這一機制目前尚無報道。本研究在證實了NO和MMPs介導(dǎo)OA時軟骨退變以及軟骨細胞過量產(chǎn)生的NO誘導(dǎo)MMP－1和MMP－13表達上調(diào)的基礎(chǔ)上，給予OA兔模型補充NG并實施運動干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CPM組比較，CPM+NG組NO含量、MMP－1和MMP－13表達量均顯著升高，雖然低于NG組，但與OA組無顯著性差異，說明CPM對MMPs表達的抑制作用可被NO逆轉(zhuǎn)，提示CPM對OA時軟骨細胞的保護作用至少部分是通過減少NO合成實現(xiàn)的。當(dāng)然，運動對OA時MMPs的調(diào)控除了NO信號途徑外，還可能存在其他不依賴于NO的信號通路，如OA時TGF－β(轉(zhuǎn)化生長因子－β)－ALK(活化素樣激酶)－Smad信號途徑可上調(diào)MMP－13表達［26］，但運動對此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用尚待進一步研究。

4 結(jié)論與展望

OA時軟骨細胞NO大量產(chǎn)生并上調(diào)MMP－1和MMP－13表達，介導(dǎo)軟骨基質(zhì)降解和軟骨損傷;CPM則通過抑制軟骨細胞NO合成下調(diào)MMP－1和MMP－13表達，進而對軟骨細胞起保護作用。這一分子機制的揭示對于臨床OA患者運動康復(fù)以及CPM與相關(guān)藥物(NO和MMPs抑制劑)的聯(lián)合應(yīng)用具有一定的理論與現(xiàn)實意義。

OA時不依賴于NO的MMPs調(diào)控機制以及運動干預(yù)的作用鮮有研究，此外，運動對軟骨組織 NOS亞型(iNOS、eNOS、nNOS)的影響以及不同運動方式、不同運動強度對OA時NO、MMPs的影響尚無報道，今后的研究應(yīng)進一步探討運動以及運動聯(lián)合藥物對OA的作用機制并最終確定OA患者運動康復(fù)療法的最佳運動方式和運動負荷以及臨床治療的最佳方案。

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