張向卉，曲雯雯，黃 薇，方 婕，吳凡子，周辛璇

（四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，成都610041）

宮內(nèi)節(jié)育器表面的細菌生物膜研究

張向卉，曲雯雯，黃 薇，方 婕，吳凡子，周辛璇

（四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，成都610041）

目的：宮內(nèi)節(jié)育器（IUD）是目前常用的長效避孕措施之一，然而眾多研究認為IUD的應(yīng)用增加了盆腔炎性疾病（PID）的發(fā)生率。近年研究發(fā)現(xiàn)細菌生物膜（BF）與感染性疾病的發(fā)生息息相關(guān)，本研究擬探究無盆腔炎疾病婦女的不同類型宮內(nèi)節(jié)育器表面是否存在BF，了解IUD是否為BF形成提供平臺，是否增加盆腔炎性疾病的易感性。方法：不同類型IUD標(biāo)本，根據(jù)表面清潔程度分別進行單獨電子掃描電鏡（SEM）觀察，單獨需氧、厭氧細菌培養(yǎng)，以及SEM觀察+培養(yǎng)了解IUD表面是否存在BF。結(jié)果：共納入IUD標(biāo)本86例，85例非PID女性的IUD，同期1例盆腔感染性疾病患者的IUD。25例進行單獨SEM觀察，陽性1例，其余標(biāo)本未見典型BF結(jié)構(gòu)。單獨細菌培養(yǎng)47例，需氧細菌培養(yǎng)陽性1例，見大面積菌苔覆蓋，考慮污染可能性大，其余標(biāo)本未見細菌生長。SEM聯(lián)合培養(yǎng)14例，細菌培養(yǎng)陽性，電鏡無陽性發(fā)現(xiàn)。其余培養(yǎng)及SEM觀察陰性。結(jié)論：不論IUD的類型如何，非PID女性體內(nèi)的IUD表面無BF存在，不同與其他體內(nèi)醫(yī)療裝置，BF的形成不能成為限制IUD應(yīng)用的理由。

宮內(nèi)節(jié)育器；盆腔炎性疾??；細菌生物膜；SEM

1 前言

宮內(nèi)節(jié)育器（IUD）是目前我國應(yīng)用最廣泛的高效可逆避孕措施[1]，然而，自IUD應(yīng)用以來，便有學(xué)者認為IUD的應(yīng)用增加女性對盆腔炎性疾?。≒ID）的易感性，增加PID的風(fēng)險[2]。

正常宮腔通常被認為是無菌的[3]，既往有研究提示IUD放置過程會使陰道及宮頸的細菌污染子宮內(nèi)膜[4，5]。隨著對細菌學(xué)及感染性疾病研究的深入，發(fā)現(xiàn)越來越多的感染性疾病，尤其是慢性及復(fù)發(fā)性感染性疾病的發(fā)生與細菌生物膜（BF）有關(guān)，BF是附著在有生命或無生命物體表面的含細菌及自身產(chǎn)生的多聚基質(zhì)的異質(zhì)性細胞結(jié)構(gòu)群體，廣泛存在于自然界、人和動物體內(nèi)。細菌生物膜是相對浮游狀態(tài)的一種適應(yīng)性的群體生存形式，與浮游細菌比較，BF內(nèi)細菌具有不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、生長代謝特點[6]，而且BF內(nèi)的微生物極具耐藥性。自從Jones等首次將掃描電子顯微鏡（SEM）用于生物膜樣結(jié)構(gòu)（slime layer，黏液層）的觀察[7]，SEM在BF的檢測領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，目前SEM是觀察BF最直觀最常用的方法之一[8，9]。

理論上，若IUD的應(yīng)用增加PID的風(fēng)險，那IUD可能會為細菌形成BF提供粘附及形成界面，本研究主要應(yīng)用SEM的觀測及細菌培養(yǎng)的方法，旨在探究非PID女性體內(nèi)的IUD表面是否存在BF。

2 材料與方法

1）IUD標(biāo)本。2014年3月至2014年9月在四川大學(xué)華西第二醫(yī)院門診手術(shù)室取出的各種IUD標(biāo)本，所有納入者術(shù)前均完成病史采集、婦科查體及實驗室檢查，了解其IUD取出原因、婚育史，有無盆腔痛、不規(guī)則陰道出血、白帶異常等，實驗室檢查主要包括經(jīng)陰道超聲、白帶常規(guī)、血常規(guī)、輸血免疫等。

本研究已獲得四川大學(xué)華西第二醫(yī)院倫理認證委員會批準(zhǔn)，所有患者術(shù)前均簽署知情同意書。

2）納入標(biāo)準(zhǔn)。研究組（非PID女性的IUD）：取環(huán)原因為生育要求，IUD時限已到，更換避孕方式等。

對照組（可疑或確診PID患者的IUD）：參照美國CDC盆腔炎性疾病2010年診斷標(biāo)準(zhǔn)，為性活躍期女性至少有宮頸舉痛、子宮壓痛或附件區(qū)壓痛。

3）排除標(biāo)準(zhǔn)。a.可疑生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。b.近3月內(nèi)使用過抗生素或者抗真菌類藥物。c.合并乙肝病毒，人類免疫缺陷病毒等傳染性疾病。d.合并有心血管、肝、腎或血液系統(tǒng)等嚴重疾病者。e.IUD取出過程困難，多次鉤取失敗。

4）標(biāo)本采集。IUD采集嚴格遵循無菌操作，IUD取出過程避免接觸陰道壁或者體外任何物體及器皿，直接置于IUD運送容器中。

3 實驗方法

IUD取出后根據(jù)表面清潔程度進行下一步實驗，表面清潔或者血跡及組織容易清洗者進行SEM觀察（或聯(lián)合細菌培養(yǎng)），表面附著較多血跡及組織，不宜SEM觀察者直接涂板，進行細菌培養(yǎng)。

3.1 SEM觀察

IUD標(biāo)本取出后完整置于緩沖液中清洗。截取長1.5～2.0 cm小段，標(biāo)本截取部分見圖1。2.5%戊二醛中固定，梯度酒精脫水，最后CO2臨界點干燥、離子濺射儀噴金后SEM觀察IUD表面有無細菌生物膜存在及細菌生物膜形態(tài)。

圖1 不同類型IUD用于SEM觀察的取材部位Fig.1 Site of different IUD used for SEM observation

3.2 細菌培養(yǎng)

IUD標(biāo)本取出后迅速于培養(yǎng)皿中涂板，涂菌棒推涂均勻，對于有尾絲IUD剪除尾絲后再涂布，防止尾絲污染平板。迅速運送回實驗室，于專性厭氧，需氧條件下培養(yǎng)24小時。然后觀察有無菌落形成、菌落形態(tài)，油鏡下革蘭染色觀察微生物形態(tài)。

4 結(jié)果

4.1 IUD使用者基本情況

共收取IUD標(biāo)本86例，其中研究組85例，可疑PID 1例，IUD使用者的基本情況見表1。

表1 IUD使用者基本情況Table 1 Base-line characteristics of IUD users

4.2 SEM觀察結(jié)果

SEM觀察25例，包括不銹鋼圓環(huán)11例，TCuIUD 9例，曼月樂3例，愛母環(huán)2例。

一名子宮縱膈術(shù)后1月的37歲女性，無腹痛、陰道流血、白帶異常等任何不適，婦科查體及B超未見異常，TCu IUD取出后SEM可見細菌生物膜結(jié)構(gòu)，可見短桿狀、球狀細菌及細胞外基質(zhì)，主要聚集在銅表面部分，聚乙烯塑料表面未見（見圖2）。圖2（a）可見IUD的聚乙烯表面有散在顆粒樣物質(zhì)附著，未見細菌生物膜；圖2（b）～（d）可見IUD銅表面見短桿狀、球狀長徑0.5～1 μm細菌及胞外基質(zhì)，簇集分布。其余IUD表面均未見細菌生物膜（見圖3）。圖3（a）可見不銹鋼圓環(huán)表面有鈣化層及少量細胞大小附著物；圖3（b）TCu IUD的聚乙烯、銅及尾絲表面，聚乙烯表面較為光滑，未見明顯附著物，銅表面較為粗糙，附著少量白細胞。尾絲表面相對清潔；圖3（c）曼月樂的橫臂表面粗糙，但未見明顯粘附物，縱臂含大量直徑10～20 μm含藥顆粒，尾絲表面光滑。

4.3 細菌培養(yǎng)結(jié)果

培養(yǎng)47例，不銹鋼單環(huán)31例，T環(huán)6例，曼月樂3例，愛母環(huán)4例，母體樂3例。其中一名44歲女性，TCu IUD使用10年，因陰道不規(guī)則流血要求取出IUD，陰道B超，白帶常規(guī)等輔助檢查及婦科查體未見異常，專性需氧培養(yǎng)可見大量片狀菌苔，考慮污染可能性大，見圖4。其余IUD細菌培養(yǎng)均為陰性。

5 SEM+培養(yǎng)結(jié)果

完成SEM+培養(yǎng)共14例，不銹鋼圓環(huán)4例，TCu IUD 5例，曼月樂3例，母體樂1例，γ環(huán)1例。所有標(biāo)本SEM均為陰性。

PID 1例，69歲女性，G4P4，不銹鋼圓環(huán)33年，因下腹疼痛要求取出IUD，無發(fā)熱、白帶異常等其他不適，婦科查體子宮壓痛，無雙附件壓痛及反跳痛，血常規(guī)正常。腹部B超未見異常。IUD取出過程中發(fā)現(xiàn)宮腔積膿約3～4 mL，光學(xué)顯微鏡下觀察考慮葡萄球菌可能性大，SEM表面未見細菌生物膜，見圖5。

需氧培養(yǎng)下為白色菌落，呈圓形，凸起，邊緣整齊，菌落直徑1～2 mm。100倍油鏡下革蘭染色陽性，細菌呈球狀，直徑約1 μm，排列成葡萄狀，未見鞭毛及芽孢。

圖2 SEM下的TCu IUD表面的細菌生物膜Fig.2 BF in the surface of TCu IUD under SEM

6 討論

IUD自20世紀(jì)30年代應(yīng)用至今，雖然有著高效可逆的避孕效果，但也被增加PID易感性的陰影所籠罩[10]，這在很多地區(qū)限制了IUD的廣泛應(yīng)用。目前為止，尚無可靠的證據(jù)表明IUD的應(yīng)用是否是PID的高危因素。

近年來，醫(yī)療裝置相關(guān)的細菌生物膜在慢性及復(fù)發(fā)性感染中的作用成為研究熱點?，F(xiàn)在的研究認為，在人體組織中，生物膜中的細菌相比浮游細菌有更強的耐藥性，對人體免疫系統(tǒng)更具抵抗力，在自然環(huán)境中則可更好的適應(yīng)環(huán)境變化，因此，只要條件允許，大多數(shù)細菌會調(diào)整生物化學(xué)、行為甚至基因特征來形成細菌生物膜[6]。醫(yī)用體內(nèi)裝置的使用解決了很多醫(yī)學(xué)難題，但這不可避免的增加了細菌形成BF的風(fēng)險，相對人體組織，體外醫(yī)療材料上更易形成BF[11]。

圖3 不同IUD的SEM下結(jié)構(gòu)Fig.3 Characteristic of different IUD under SEM

圖4 需氧細菌培養(yǎng)菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of aerobic bacterial culture

圖5 可疑PID患者細菌菌落及鏡下形態(tài)Fig.5 Colony morphology and microscopic characteristics of PID patient

BF相對牢固，IUD取出過程中不易破壞，污染的浮游菌也可在清洗過程中去除，另外，無論細菌的生存狀態(tài)如何，SEM均可觀察到，相對傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)，SEM可有力的證實細菌是否存在。理論上，若IUD增加PID的風(fēng)險，其使用使原本無菌的宮腔受到陰道菌群的污染[12]，那相比每月定時脫落的子宮內(nèi)膜，細菌更可能會在IUD表面形成BF。筆者的研究并不支持這種假設(shè)，完成SEM觀察的38例非PID女性中，僅1例IUD表面見BF結(jié)構(gòu)，BF陽性者IUD使用時限較短，僅為1月，患者無PID的臨床表現(xiàn)，實驗室檢查正常，該結(jié)果支持早期的一些研究，即對子宮切除術(shù)后的IUD直接取出培養(yǎng)，結(jié)果顯示IUD放置的24小時內(nèi)陽性率最高，隨后逐漸降低，30天后完全消失，可能IUD放置過程中會將宮頸及陰道內(nèi)的細菌帶入宮腔，但隨著時間的延續(xù)，宮腔內(nèi)的細菌可完全消除[5]。但本研究中另有IUD使用1月取出2例并未發(fā)現(xiàn)BF，提示BF在非PID女性的IUD表面存在率很低。

鑒于部分IUD標(biāo)本表面血跡及內(nèi)膜組織無法清除，不宜采用SEM觀察，本研究旨在聯(lián)合傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)證實IUD表面是否存在BF。但是研究中非PID女性IUD細菌培養(yǎng)的陽性率幾乎為零。早期學(xué)者證實IUD放置的24小時內(nèi)細菌培養(yǎng)陽性率最高，隨后逐漸降低，30天后完全消失[5]。

受研究時限的限制，本研究中僅納入一名PID對照者，表現(xiàn)為宮腔積膿，IUD取出前未曾接受抗生素治療，患者年齡較大，無發(fā)熱及血象改變，細菌培養(yǎng)提示葡萄球菌可能性大，但是SEM觀察未見明顯細菌生物膜結(jié)構(gòu)，可能與BF內(nèi)的細菌釋放分散有關(guān)。

本研究也有不當(dāng)之處，研究人群平均年齡較高，為非性活躍期女性，多為經(jīng)產(chǎn)婦，有穩(wěn)定的婚姻或者兩性關(guān)系，是PID的低危人群，一些隱性PID的發(fā)生率也低，另外，本研究未對IUD表面是否存在淋病奈瑟菌及沙眼衣原體進行檢測，這些可能對研究結(jié)果有一定影響。而且，未能納入足夠數(shù)量的PID女性，對PID女性體內(nèi)IUD的研究不夠。

綜上所述，筆者的研究認為非PID女性體內(nèi)的IUD表面不存在細菌生物膜，也不會成為PID發(fā)生的潛在危險。相比其他體內(nèi)醫(yī)療裝置，BF的形成不應(yīng)該成為限制IUD廣泛應(yīng)用的理由。

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Research about bacteriology on intrauterine device

Zhang Xianghui，Qu Wenwen，Huang Wei，F(xiàn)ang Jie，Wu Fanzi，Zhou Xinxuan
（West China Second University Hospital，Chengdu 610041，China）

Background：Intrauterine device（IUD）is one of the most popular method of longacting contraception，while concerns still exist as to whether the use of IUD increases the risk of pelvic inflammatory disease（PID）.In recent years many issues have been extensively researched about the relationship between bacterial biofilm（BF）and infectious diseases.We designed this study to investigate whether BF exists on IUD of non PID women；and whether IUD increases the susceptibility to PID.Methods：For the study，we recruited 85 participants without PID and a PID patient who choosed IUD as a means of contraception.According to the cleanliness of IUD surface.IUD was removed and sent for scanning electron microscopy（SEM）or/and biological and fungal examination respectively to detect BF.Results：A total of 86 IUDs were recruited，which include stainless steel ring，TCuIUD，Mirena，Multiload，McuIUD and γCu380 IUD.Among 25 IUDs which were observed with SEM alone，BF was discovered on a TCuIUD used for one month-a large number of bacilli/cocci and extracellular matrix coverd on the surface of copper.Other specimens had no significant discoveries.The result of 47 microbial culture alone was negative except for one suspected contaminated IUD.14 IUDS were investigated via both microbial culture and SEM.A 33 year old stainless steel ring which removed because of the symptoms of pelvic pain，aerobic cultivation was positive.But there was no BF detected by SEM.The remaining 13 IUD had no positive result.Conclusions：There was no BF on surface of IUD removed from non-PID women regardless of IUD type；unlike other medical device，the formation of bacterial biofilm should not become a stumbling.

intrauterine device；pelvic inflammatory disease；bacterial biofilm；scanning electron microscopy

R715.2

A

1009-1742（2015）06-0021-07

2015-04-29

宮內(nèi)節(jié)育器表面生物膜及細菌粘附機制(0040215401128)

張向卉，1988年出生，女，山東慶云縣人，碩士，主要研究方向為婦科生殖內(nèi)分泌及計劃生育；E-mail：zhxh_l@163.com