白 陽（國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作廣東中心，廣東 廣州 510530）

菌落總數(shù)測試片研究進(jìn)展

白 陽
（國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作廣東中心，廣東 廣州 510530）

菌落總數(shù)作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，具有重要的衛(wèi)生學(xué)意義。菌落總數(shù)測試片具有攜帶方便、不用配制培養(yǎng)基的優(yōu)點，是一種新型的檢測工具。近年來專家學(xué)者圍繞菌落總數(shù)測試片進(jìn)行了相關(guān)研究。對這些研究進(jìn)行分析和綜合，具有一定的理論價值和現(xiàn)實指導(dǎo)意義。

菌落總數(shù)；測試片；研究進(jìn)展

食品是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，而食品安全關(guān)系到人們的健康和國計民生，已經(jīng)越來越受重視。隨著社會的進(jìn)步，人們的生活水平不斷提高，有關(guān)部門加大了食品安全方面的執(zhí)法力度，其中菌落總數(shù)是食品衛(wèi)生檢驗中最基本、最常見的微生物指標(biāo)檢測項目。國際微生物規(guī)格委員會將菌落總數(shù)定義為在被檢樣品的單位重量（g）、容積（mL）或表面積（cm2）內(nèi)，所含能于某種固體培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)后所生成的菌落的總數(shù)。菌落總數(shù)是判定食品被細(xì)菌污染程度的重要標(biāo)志，能反映食品加工及儲藏過程是否符合食品衛(wèi)生要求。通常認(rèn)為，食品中細(xì)菌數(shù)量越多，致病菌污染的可能性越大。菌落總數(shù)還可用于觀察食品中微生物的性質(zhì)以及微生物在食品中繁殖的動態(tài)，以便在對被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價時提供科學(xué)依據(jù)。近年來，隨著環(huán)境污染的加劇和生態(tài)平衡的破壞，人類感染的致病菌的種類越來越多，病原微生物對人類的威脅越來越大，因此，采用適當(dāng)?shù)臋z驗方法對食品菌落總數(shù)進(jìn)行檢測，是預(yù)防食源性中毒的重要手段。

1 食品中常見的微生物

引起食品污染的微生物種類繁多。有的是在食品加工過程中被外界污染的細(xì)菌，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等；有的是新鮮食品上正常的菌群在加工過程中殘留下來的微生物，如乳酸菌等；有的是食品工業(yè)上重要的發(fā)酵菌，如酵母菌等。某些殘留的細(xì)菌不僅可能引起食品腐敗變質(zhì)，還可能引起疾病。目前食品中常見的微生物有19個種屬，具體見表1。

表1 食品中常見的微生物菌屬

續(xù)表1

2 菌落總數(shù)傳統(tǒng)檢驗方法

目前國內(nèi)食品中的菌落測定主要是按GB／T 4789.2—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，采用平板計數(shù)法。根據(jù)樣品的實際污染情況，對樣品進(jìn)行 10倍遞增稀釋，選擇 2～3個適宜稀釋度的樣品勻液，吸取 1 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿；將融化并冷至 45～50℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注到各平皿內(nèi)，每皿15～20 mL，隨即轉(zhuǎn)動平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置于36±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48±2 h；另取一個不加樣品的滅菌空平皿，加入 15～20 mL平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置于36±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48±2 h，作為空白對照；按照 GB／T 4789.2—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。一般來說，傳統(tǒng)培養(yǎng)基成本較低，但采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行菌落總數(shù)測定存在明顯不足［1］：一是培養(yǎng)基制備、儀器清洗、滅菌都需要較多的時間和人力，費時費力；二是由于傳統(tǒng)方法一般需要較長時間，且需要特定的溫度，對實驗室儀器及無菌條件要求較高，不適合野外操作；三是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法中如果培養(yǎng)基的溫度過高，容易使待測樣品中的微生物因不適宜而受損，從而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 菌落總數(shù)測試片

隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，先進(jìn)的檢測方法不斷出現(xiàn)。目前美國 3M公司的菌落總數(shù)測試片法在世界各地使用得比較多。菌落總數(shù)測試片是指以滅菌濾紙、無紡布或冷水可溶凝膠等吸收培養(yǎng)基作為載體，將特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)附著在載體上面，通過微生物在其上面的生長、顯色情況來測定食品中微生物的一種產(chǎn)品。菌落總數(shù)測試片的顯著優(yōu)點［2］：第一，可測定少量檢品，不需要配制試劑和大量的玻璃器皿，操作簡便，經(jīng)濟(jì)，實用；易于消毒保存，攜帶方便，價格低廉，能大大減少或消除對環(huán)境的污染，能減少試驗后的清洗工作，能克服熱瓊脂法不適宜受損細(xì)菌恢復(fù)的缺陷，故適用于實驗室、生產(chǎn)現(xiàn)場和野外工作環(huán)境。第二，可以在取樣的同時接種，結(jié)果更能真實地反映當(dāng)時樣本中的細(xì)菌數(shù)，防止由于細(xì)菌繁殖造成的數(shù)量增多。第三，不用進(jìn)行使用前的準(zhǔn)備工作，能大大節(jié)省時間、人力和物力。

3.1 菌落總數(shù)測試片研究進(jìn)展

3.1.1 菌落總數(shù)測試片載體

目前，濾紙、無紡布和冷水可溶性凝膠是 3種最常見的載體［3］。

濾紙。由于濾紙具有較大的間隙，用濾紙作載體，濾紙雙面和纖維之間容易有菌落生長，使肉眼無法準(zhǔn)確判斷，所以測定結(jié)果一般比實際菌數(shù)要少；濾紙保水性差，檢驗培養(yǎng)時又不能保持充分濕度，不利于菌體生長；濾紙檢驗卡存在營養(yǎng)物質(zhì)分布不均勻的問題，加樣也不能迅速擴(kuò)散，致使菌體生長分布不均勻；由于顯色指示劑系統(tǒng)單一，不能有區(qū)別地對細(xì)菌進(jìn)行計數(shù)，對真菌更差，所以很難全面推廣。

無紡布。無紡布是以紡織纖維為原料，經(jīng)過黏合、熔合或其他化學(xué)、機(jī)械方法加工而成的紡織品。無紡布有薄型和厚型兩大類，可用以制成有透氣、防毒和加速擴(kuò)散等特殊用途的材料。德國拜發(fā)公司的RIDA?COUNT微生物菌落計數(shù)板和日本 CHISSO公司的SANITA-KUN微生物快速檢測片，都是以無紡布為載體的新型檢測片。無紡布加樣后能迅速擴(kuò)散，菌體生長分布均勻；但無紡布和濾紙型菌落總數(shù)測試片都不能挑菌作進(jìn)一步實驗，因而影響其應(yīng)用前景。

冷水可溶性凝膠。冷水可溶性凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、透明、回收率高，且可進(jìn)行挑菌，方便對微生物做進(jìn)一步鑒定，使得此類測試片的綜合評價較高，具有廣闊的應(yīng)用前景。冷水可溶性凝膠劑一般不是微生物的營養(yǎng)成分，只起固化或黏合作用。3M公司的菌落總數(shù)測試片就是以冷水可溶性凝膠為載體的。理想的凝膠劑應(yīng)具備以下條件：不會被微生物分解利用，不會因高溫滅菌而受到破壞，在微生物生長的溫度范圍內(nèi)保持固體狀態(tài)，對微生物及操作人員均無毒害作用，透明度好、凝固力強(qiáng)、價格低廉、配制方便。常見的凝膠劑有瓊脂、羧甲基纖維素鈉、明膠、丙烯酸鈉等［4］。目前關(guān)于測試片中凝膠劑的報道較少：國外，僅在美國的專利中報道過瓜爾膠、黃原膠、刺槐豆膠、聚丙烯酸系高分子化合物等，但報道得并不明確，也不系統(tǒng)；國內(nèi)，廣東環(huán)凱微生物測試科技有限公司研制的聚丙烯酸鈉可以作為菌落總數(shù)測試片的凝膠劑。

3.1.2 菌落總數(shù)測試片顯色培養(yǎng)基

一般的顯色培養(yǎng)基由營養(yǎng)物質(zhì)、誘導(dǎo)劑和顯色劑組成。目前有關(guān)菌落總數(shù)顯色劑的報道比較單一，主要集中在氯化三苯四氮唑（TTC）和噻唑藍(lán)（MTT）上。TTC是目前最常用的顯色劑，并已成功應(yīng)用到菌落總數(shù)測試片上。TTC是一種氧化劑，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)具有脫氫酶，在細(xì)菌脫氫酶的作用下，TTC接受氫（H）成為紅色而穩(wěn)定的三苯甲臜，使菌落呈現(xiàn)紅色，在細(xì)菌培養(yǎng)中，細(xì)菌在一定濃度TTC的培養(yǎng)基中生長而形成的菌落呈現(xiàn)紅色。在菌落總數(shù)測試片中形成紅色點狀物，出現(xiàn)在測試片之上，紅點的總數(shù)就是細(xì)菌的總數(shù)，這樣計數(shù)更加準(zhǔn)確。據(jù)報道，TTC濃度過高會對細(xì)菌的生長產(chǎn)生抑制作用，所以菌落總數(shù)測試片中 TTC的濃度要以能靈敏顯示細(xì)菌生長情況且對細(xì)菌無副作用為宜。當(dāng)培養(yǎng)基中的TTC濃度為0.005% ～0.01%時，基本無抑菌現(xiàn)象。誘導(dǎo)劑的添加情況對菌落總數(shù)測試片的快速檢測結(jié)果有重要影響。菌落總數(shù)測試片講究快速，由于一部分細(xì)菌在24 h后才逐漸顯現(xiàn)，所以在顯色培養(yǎng)基中加入一些誘導(dǎo)物質(zhì)以促進(jìn)細(xì)菌快速生長顯得尤為重要。常見的誘導(dǎo)劑有血消化液、胱氨酸、肝心浸液等。1999年有報道顯示，在培養(yǎng)基中加入生長促進(jìn)因子血消化液，可使這部分細(xì)菌在16 h后就能生長出來，而不加促進(jìn)因子的培養(yǎng)基在 24 h后才開始生長。2004年有報道顯示，胱氨酸等物質(zhì)不僅具有增菌作用，還能增強(qiáng)顯色劑的色度。營養(yǎng)物質(zhì)方面除了要保證各類細(xì)菌生長所需的營養(yǎng)外，還應(yīng)充分考慮顯色培養(yǎng)基緩沖體系，可以添加氯化鈉和磷酸二氫鉀等緩沖劑，以保證細(xì)菌平衡，不受損傷。

3.2 菌落總數(shù)測試片產(chǎn)品

目前比較成熟的菌落總數(shù)測試片產(chǎn)品主要有美國3M公司的PetrifilmTM細(xì)菌總數(shù)測試片和德國拜發(fā)公司的 RIDA?COUNT微生物菌落計數(shù)板。廣東環(huán)凱微生物科技有限公司也致力于菌落總數(shù)測試片的研究，并取得實質(zhì)性進(jìn)展。

3.2.1 美國3M公司的PetrifilmTM細(xì)菌總數(shù)測試片

美國3M公司發(fā)明的用于菌落計數(shù)的可再生水合物干膜（PetrifilmTMAerobie Count Plates）目前處于世界領(lǐng)先地位。它由上下兩層薄膜組成，下層的聚乙烯薄膜上印有網(wǎng)格且覆蓋有培養(yǎng)基，上層是聚丙烯薄膜。培養(yǎng)基中含有微生物生長及生化實驗所需的營養(yǎng)及試劑，并通過一種冷水可溶性凝膠劑附著在上下兩層膜上。常用的凝膠劑為果阿膠，另外還有黃原膠、洋豆膠等。生化試劑有特異性顯色物質(zhì)和抗生素。待測樣品處理后不需要增菌，直接接種測試片，適宜溫度培養(yǎng)后計數(shù)。測試片的外觀呈長方形，未開封的鋁箔袋冷藏于8℃的冰箱中，已開封的鋁箔袋應(yīng)用膠帶將封口封緊，置于常溫干燥處。

3M公司的PetrifilmTM測試片已通過國際組織AFNOR、FDA和AOAC的認(rèn)可。使用方法：揭起覆蓋的膠片，將 1 mL樣品懸液滴于測試片中央后蓋回，用壓板輕輕壓下，將樣品均勻地覆蓋于培養(yǎng)基上，靜置約1 min，使培養(yǎng)基中的凝膠固化；將測試片水平放于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)菌總數(shù)測試片培養(yǎng)48±3 h后所計的紅色菌落數(shù)即為細(xì)菌總數(shù)。

近年來，美國3M公司對測試片做了很大的改進(jìn)，在樣品接種后48 h可準(zhǔn)確報告結(jié)果。盧行安等對所選定的8類未加工和已加工食品進(jìn)行菌落總數(shù)測定，利用3M公司的 PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片測試，結(jié)果與采用 GB／T 4789.2—2010標(biāo)準(zhǔn)測定所得無統(tǒng)計學(xué)差異［5］。Heddeghen等用美國 3M公司測試片對鮮奶進(jìn)行檢測，其重復(fù)性較好。唐漪炎報道，采用3M公司的 PertifilmTM細(xì)菌總數(shù)測定紙片對消毒奶、酸奶、乳酸飲品、黃油、冰激凌、脫脂奶粉、奶酪、布丁、生奶等十余種產(chǎn)品進(jìn)行檢測，48±3 h報告結(jié)果，經(jīng)統(tǒng)計對比，兩種方法無顯著差別，細(xì)菌總數(shù)測定紙片法檢出率比國標(biāo)法高。

雖然3M公司的PetrifilmTM測試片具有快速、方便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點，但仍存在一些不足：價格昂貴，目前尚不適合在食品生產(chǎn)企業(yè)及基層單位全面推廣；PetrifilmTM測試片上覆蓋一層薄膜，當(dāng)細(xì)菌產(chǎn)氣、產(chǎn)黏液過多時會出現(xiàn)菌落的擴(kuò)散，影響計數(shù)；計數(shù)方面，PetrifilmTM測試片面積較小，當(dāng)菌量大于 250 cfu時，準(zhǔn)確計數(shù)較困難；待測樣品中含有的某些有機(jī)物可能會使顯色減緩，從而降低目測效果，導(dǎo)致計數(shù)偏低；培養(yǎng)基吸水較慢，如果在未均勻分布前用力擠壓，會使稀釋液體從邊緣流出，影響結(jié)果；PetrifilmTM載體底板不透明，光源不能透射，不能用自動計數(shù)儀計數(shù)，需更多人力物力。

3.2.2 德國拜發(fā)公司的 RIDA?COUNT微生物菌落計數(shù)板

德國拜發(fā)公司的 RIDA?COUNT微生物菌落計數(shù)板選用的載體為硝酸纖維素型無紡布，它是一種將脫水培養(yǎng)基附著于無紡布棉墊上的即用型檢測產(chǎn)品，由上下兩部分組成，上層為透明覆蓋膜，下層自上而下為無紡布層、底層涂有黏性物料的薄片和包含了培養(yǎng)基的水溶性復(fù)合膜。當(dāng)樣品液滴加在無紡布上時，會立刻擴(kuò)散并溶解于復(fù)合膜內(nèi)，形成高黏性的溶液，經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。

德國拜發(fā)公司的 RIDA?COUNT微生物菌落計數(shù)板已經(jīng)獲得國際組織 AOAC的認(rèn)可。使用方法：揭開覆蓋膜，將1 mL樣品懸液緩緩且均勻地滴于無紡布上，靜置5 s，待樣液完全吸收后，緩緩地將覆蓋膜蓋回，注意不要壓蓋無紡布部分，可沿薄膜邊緣壓緊；將接種后的測試片水平放于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)菌總數(shù)測試片培養(yǎng) 48±2 h后所計紅色菌落數(shù)即為細(xì)菌總數(shù)。這種微生物菌落計數(shù)板的不足是：不能兩面數(shù)菌，易遺漏，影響計數(shù)；加樣液后容易出現(xiàn)褶皺；不能挑菌作進(jìn)一步實驗。

4 結(jié)語

目前，食品安全問題已受到全社會的關(guān)注。食品安全檢測產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，菌落總數(shù)的傳統(tǒng)檢測方法能較好地對菌落總數(shù)進(jìn)行檢測。在GB／T 4789.2—2008和 SN／T 1987—2007標(biāo)準(zhǔn)中，菌落總數(shù)測試片法是菌落總數(shù)測定的方法之一?？梢灶A(yù)見，菌落總數(shù)測試片法將逐步成為傳統(tǒng)檢測手段的重要補充，甚至可能逐步成為主流的檢測方法。菌落總數(shù)測試片具有良好的市場發(fā)展前景，但到目前為止，還未見過由我國自主研發(fā)的具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性的菌落總數(shù)測試片產(chǎn)品的相關(guān)報道，對菌落總數(shù)的檢測仍主要采用傳統(tǒng)的方法或購買較昂貴的國外產(chǎn)品，這對我國食品檢測技術(shù)的發(fā)展造成了一定的阻障。因此，研發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)、具有高靈敏度和高特異性的菌落總數(shù)測定產(chǎn)品成為一項重要且緊迫的任務(wù)。

［1］吳毓薇，吳許文，吳清平，等.食品衛(wèi)生微生物測試片檢測技術(shù)進(jìn)展［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，（12）：2832－2834.

［2］李鐵牛.紙片法檢測飲料中菌落總數(shù)的研究［D］.重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［3］孫永.食品衛(wèi)生微生物快速測試卡的研制［D］.北京：中國科學(xué)院研究生院，2007.

［4］呂嘉櫪，韓迪.MTT和 TTC在嗜酸乳桿菌菌落計數(shù)中的應(yīng)用［J］.中國乳品工業(yè)，2007，（4）：23－25.

［5］盧行安，顧其芳，袁寶君，等.AOAC PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片法與食品中菌落總數(shù)測定國標(biāo)方法的比較研究［J］.中國食品學(xué)報，2011，（3）：164－167.

［責(zé)任編輯：羅 香］

Research Progress in Test Piece of Aerobic Bacterial Count

BAI Yang
（Patent Examination Cooperation Center of the Patent Office，SIPO，Guangzhou 510530，Guangdong，China）

As a target for the extent of contamination in food，aerobic bacterial count is very important in sanitization，and it is a new kind of detection tool which is convenient to carry and free of media preparation.In recent years，experts and scholars have carried out some investigations on aerobic count.The comprehensive analysis for these studies has certain theoretical value and practical guiding significance.

aerobic bacterial count；test piece；research progress

TS201.6

：A

：1006－8481（2015）02－0001－04

2014－11－02

白陽（1987—），男，國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作廣東中心，碩士。