龔 燕，楊婷婷，莫曉嵩，張海濤，黃 偉，陸廷瑾，張東升,*，汪海峰

（1.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇 無(wú)錫 214063；2.江蘇省糧食局糧油質(zhì)量監(jiān)測(cè)所，江蘇 南京 210011；3.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210011）

基于蛋白A-瓊脂糖凝膠黃曲霉毒素B1免疫親和柱的制備

龔 燕1，楊婷婷1，莫曉嵩2，張海濤1，黃 偉2，陸廷瑾1，張東升1,*，汪海峰3

（1.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇 無(wú)錫 214063；2.江蘇省糧食局糧油質(zhì)量監(jiān)測(cè)所，江蘇 南京 210011；3.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210011）

將初步純化的抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體，定向偶聯(lián)于蛋白A-瓊脂糖凝膠，制備成免疫親和層析柱。結(jié)果顯示，辛酸-飽和硫酸銨純化后的單抗質(zhì)量濃度為17.5 mg/mL，純度為45.1%，抗體亞型為IgG1。取純化后抗體48 ?L與1 mL蛋白A凝膠偶聯(lián)，偶聯(lián)率達(dá)98.1%，高效液相色譜測(cè)定其平均相對(duì)柱容量為105 ng/0.125 mL凝膠、柱空白為0，不同樣品（玉米粉、面粉、花生油、醬油、醋等）平均加標(biāo)回收率在80%以上。該親和柱在2～8℃保存12 個(gè)月后，相對(duì)柱容量仍可達(dá)72 ng/0.125 mL凝膠。該法制備的親和柱相對(duì)柱容量大，穩(wěn)定性好，可用于樣品中黃曲霉毒素B1分離凈化的要求。

黃曲霉毒素B1；蛋白A-瓊脂糖凝膠；定向偶聯(lián)；免疫親和柱

黃曲霉毒素是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的代謝物，其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的毒性和致癌性最強(qiáng)，被稱為第一大類致癌物[1]。目前，對(duì)于AFB1的檢測(cè)方法有薄層層析法[2-3]、酶聯(lián)免疫吸附法[4-9]、免疫親和層析-高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法[10-12]、免疫親和層析-熒光光度法等[13-14]。免疫親和層析柱（immunoaffinity column， IAC）因其高特異性、高靈敏度及凈化效果好等優(yōu)勢(shì)，是目前真菌毒素凈化和富集效能最強(qiáng)的樣品前處理技術(shù)。為避免非特異性吸附的雜質(zhì)干擾后續(xù)使用和加快分析速度，增加一次性IAC用量，針對(duì)真菌毒素殘留IAC柱的制備成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

目前，國(guó)內(nèi)外多采用溴化氰活化的瓊脂糖為載體[15-17]，以隨機(jī)偶聯(lián)的方式將抗體分子無(wú)序地固定在層析介質(zhì)上制備親和柱，而當(dāng)鍵合位置靠近抗體的結(jié)合位點(diǎn)指向有礙與待測(cè)物結(jié)合的空間時(shí)，則抗體的結(jié)合能力下降，造成抗體分子被低效利用[18]。為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本研究采用蛋白A-瓊脂糖凝膠作為固相載體，與辛酸-飽和硫酸銨初步純化的抗AFB1單克隆抗體定向偶聯(lián)，制備一次性、高載量、低成本的IAC，考察較小的柱床體積下完成樣品凈化的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉（散裝）、面粉（風(fēng)箏牌）、黃豆醬油（好太太）、香醋（鎮(zhèn)江恒順）等樣品均為市購(gòu)；花生油（CNCA能力驗(yàn)證樣品，編號(hào)CNCA-13-B15-8） 青島出入境檢驗(yàn)檢疫局；抗AFB1單克隆抗體細(xì)胞株SW-1 E10由江蘇省蘇微微生物研究有限公司實(shí)驗(yàn)室篩選并凍存。

蛋白A-瓊脂糖凝膠 美國(guó)GE Healthcare公司；二甲基庚二亞胺二鹽酸鹽、AFB1標(biāo)準(zhǔn)品、石蠟、弗氏完全、不完全佐劑 美國(guó)Sigma公司；甲醇（色譜純） 德國(guó)Merck公司；AFB1酶聯(lián)免疫測(cè)試盒 江蘇省蘇微微生物研究有限公司；小鼠亞類鑒定試劑盒 美國(guó)Proteintech公司；雌性BALB/c小鼠 揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 奧地利GBC公司；LC-20AT HPLC儀（含RF-20Axs） 日本島津公司；Nova-Pak?C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，4 μm） 美國(guó)Waters公司；PHRED-HR后光化學(xué)衍生器 北京中科匯仁科技有限公司；HS-3垂直混勻器 寧波新芝生物公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；ZKY-1001真空泵 上海嘉鵬科技有限公司；砂芯漏斗、CO2培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技公司；凈化工作臺(tái) 蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腹水的制備、純化及鑒定

抗AFB1小鼠腹水的制備參考Chu等[19]的操作步驟。取制備的抗AFB1單克隆抗體的小鼠腹水，采用辛酸-飽和硫酸銨法[20]進(jìn)行初步純化，0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）透析得純化抗體，小份量分裝并-70 ℃保存。純化后的抗體采用小鼠亞類鑒定試劑盒進(jìn)行亞型鑒定。取1 mL純化單抗過(guò)蛋白A親和層析柱，甘氨酸-HCl（pH 3.0）洗脫蛋白A親和柱上的結(jié)合單抗，收集流出液、洗脫液，紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法[21]測(cè)定純化后抗AFB1單克隆抗體的純度。蛋白質(zhì)量濃度見(jiàn)式（1），抗體純度計(jì)算見(jiàn)式（2）。

1.3.2 親和柱的制備

參照Sisson等[22]的方法略有改變。1）膠的洗滌:取1 mL 蛋白A-瓊脂糖凝膠于砂芯漏斗中，用20 mL PBS沖洗2 次，之后用10 mL PBS轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中；2）偶聯(lián):取48 μL純化后的單抗（1.3.1節(jié)）加入到處理好的膠中，室溫垂直混勻1 h，使抗AFB1單克隆抗體與蛋白A充分偶聯(lián)。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，收集反應(yīng)液，紫外分光光度法測(cè)定反應(yīng)液中未偶聯(lián)的蛋白含量，計(jì)算偶聯(lián)率，見(jiàn)公式（3）；3）交聯(lián):抽干膠后，用0.2 mol/L三乙醇胺溶液洗膠1 次，最后用10 mL 0.2 mol/L三乙醇胺溶液轉(zhuǎn)移膠至離心管中，并緩慢加入20 mg DMP，室溫垂直混勻反應(yīng)30 min；4）終止反應(yīng):抽干膠后，用20 mL 0.2 mol/L三乙醇胺溶液洗滌1 次，然后加入20mL 50 mmol/L乙醇胺溶液，室溫反應(yīng)5 min；5）洗滌:抽干膠后，加入20 mL甘氨酸-HCl（pH 3.0），室溫反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后，20 mL PBS洗滌2 次，并用PBS（含5‰防腐劑)懸浮至4 mL；6）裝柱:取處理好的1 mL柱管及篩板，將下篩板墊好后，取500 μL懸好的膠（相當(dāng)于0.125 mL膠/支）加入管中，4 ℃沉降過(guò)夜后，將上篩板及上下堵頭塞好，2～8 ℃冰箱保存。

1.3.3 AFB1HPLC測(cè)定色譜條件

色譜柱:Nova-Pak?C18（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流動(dòng)相:甲醇-水（45∶55，V/V）；流速: 0.7 mL/min；柱后光化學(xué)衍生系統(tǒng)；熒光檢測(cè)器:發(fā)射波長(zhǎng)365 nm、激發(fā)波長(zhǎng)440 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積:20 μL。

1.3.4 抗AFB1單克隆抗體含量與相對(duì)柱容量的關(guān)系

取1 mL凝膠分別加入30、65、480、900 μL單抗，按照1.3.2節(jié)制備AFB1免疫親和柱。分別測(cè)定其相對(duì)柱容量（各取3 支親和柱平行測(cè)定，取其平均值，即n=3），通過(guò)公式（4）、（5）計(jì)算柱容量和單抗有效的利用率。

1.3.5 親和柱的評(píng)價(jià)

1.3.5.1 相對(duì)柱容量

取制備好的親和柱，將一定體積的50 ng/mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液（10%甲醇-PBS溶液配制）以1 滴/2 s的速率過(guò)親和柱，流出液重復(fù)過(guò)柱一次，當(dāng)IAC柱結(jié)合能力飽和后，收集流出液，用20 mL水溶液洗滌除雜，最后用1.0 mL甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，用HPLC檢測(cè)，按式（6）計(jì)算相對(duì)柱容量。

1.3.5.2 柱空白

按照1.3.2節(jié)制備步驟，僅在偶聯(lián)過(guò)程中用PBS取代單抗，其他步驟都一樣，制備空白柱。按照1.3.5.1節(jié)柱容量的測(cè)定過(guò)程來(lái)檢測(cè)AFB1在該空白柱中的保留情況。

1.3.6 上樣緩沖液流速的選擇

AFB1的上樣量為45 ng，分別以2、1 滴/s、1 滴/2 s的流速通過(guò)柱體，收集流出液及甲醇洗脫液，HPLC法測(cè)定其中AFB1的含量，進(jìn)而確定最佳上樣流速。

1.3.7 洗脫液體積及甲醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

AFB1上樣量為45 ng，分別用1～3 mL 50%、80%甲醇溶液和100%甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，用HPLC法測(cè)定其中AFB1含量，確定最佳洗脫條件。

1.3.8 不同質(zhì)量濃度的回收率

分別取1 mL質(zhì)量濃度為0、1、5、10、20、50 ng/mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)6 支免疫親和柱，用1 mL純甲醇洗脫，收集洗脫液用HPLC法測(cè)定AFB1含量，計(jì)算回收率。

1.3.9 不同樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定

1.3.9.1 玉米粉不同加標(biāo)水平回收率

分別將25、100、250 ng AFB1標(biāo)準(zhǔn)品加入到5 g粉碎的玉米樣品（經(jīng)HPLC及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定AFB1含量為0水平）中，加入1 g NaCl，再加入25 mL 70%甲醇-水，振蕩30 min，過(guò)濾收集濾液。取10 mL濾液加入20 mL水混勻，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾，取15 mL濾液過(guò)柱。收集1 mL純甲醇洗脫液，待測(cè)。

1.3.9.2 面粉、花生油加標(biāo)回收

分別將110 ng AFB1標(biāo)準(zhǔn)品加入到5.0 g的面粉樣品及花生油中，樣品提取及過(guò)柱純化方法同1.3.9.1節(jié)，同時(shí)做空白對(duì)照。

1.3.9.3 醬油加標(biāo)回收

將100 ng的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品加入到5.0 g陰性樣品中，加入0.25 g NaCl，再加入80%甲醇-水至10 mL，振蕩30 min，過(guò)濾收集濾液。取5 mL濾液加入20 mL水混勻，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7.0左右，玻璃纖維濾紙過(guò)濾，取10 mL過(guò)柱。收集1 mL色譜純甲醇洗脫液，待測(cè)。

1.3.9.4 醋加標(biāo)回收

將100 ng AFB1標(biāo)準(zhǔn)品加入到5.0 g樣品中，加入1.0 g NaCl，用pH 7.0的PBS稀釋至25 mL，振蕩30 min，過(guò)濾收集濾液。取10 mL濾液加入10 mL pH 7.0的PBS混勻，玻璃纖維濾紙過(guò)濾，取10 mL過(guò)柱。收集1 mL色譜純甲醇洗脫液，待測(cè)。同時(shí)做空白對(duì)照。樣品的加標(biāo)回收率按公式（7）計(jì)算:

1.3.10 重復(fù)使用次數(shù)和穩(wěn)定性

同一支使用后的親和柱經(jīng)2 mL 70%甲醇溶液沖洗再生，最后用10 mL PBS緩沖溶液沖洗柱子，放4 ℃保存，隔天測(cè)定相對(duì)柱容量。將60 支制備好的親和柱，于2～8 ℃保存，每隔1 個(gè)月取3 支測(cè)定相對(duì)柱容量，繪制變化曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗AFB1單克隆抗體純化前后蛋白質(zhì)量濃度和SDSPAGE測(cè)定結(jié)果

表1 純化單抗的質(zhì)量濃度及純度測(cè)定結(jié)果Table1 The concentration and purity of Mc-Ab

辛酸-飽和硫酸銨純化后，結(jié)果見(jiàn)表1。蛋白質(zhì)量濃度為17.5 mg/mL，蛋白A柱純化流出液蛋白質(zhì)量濃度8.5 mg/mL，酸洗脫得到的蛋白質(zhì)量濃度為2.4 mg/mL。通過(guò)計(jì)算得抗體純度為45.1%，通過(guò)小鼠亞類鑒定試劑盒測(cè)定的單抗亞型為IgG1。

圖1 抗AFB1單克隆抗體純化前后SDS-PPAAGGEE圖Fig.1 SDS-PAGE of anti-AFB1Mc-Ab before and after purification

由圖1可以看出，辛酸-硫酸銨純化后的抗體仍含較多的雜蛋白，通過(guò)蛋白A親和柱純化后抗體較純，有重鏈（約57 kD）和輕鏈（約25 kD）2 條清晰的條帶。通過(guò)2、3泳道的條帶發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致，辛酸-飽和硫酸銨純化后的抗體再經(jīng)過(guò)蛋白A親和柱純化，流出液為雜蛋白，而偶聯(lián)后有效單抗基本結(jié)合，雜蛋白保留在反應(yīng)液中，通過(guò)計(jì)算偶聯(lián)率為98.1%。

2.2 抗AFB1單克隆抗體含量與相對(duì)柱容量的關(guān)系

取純化抗體體積為30、65、480、900 μL時(shí)，制備的AFB1親和柱平均相對(duì)柱容量分別為61.7（變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)為5.3%）、135.0（CV為6.6%）、994.2（CV為4.7%）、1 816（CV為3.3%）ng/0.125 mL，相對(duì)柱容量隨抗體含量的增加而增大。以每支固載的抗體含量（mg）為橫坐標(biāo)，以相對(duì)柱容量（ng/0.125 mL）為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程:y=2 047.9x+ 6.719 3，R2=0.999 8。結(jié)果表明，7.10 mg單抗（900 μL純化單抗所含有的抗AFB1單抗的量）與1 mL蛋白A-凝膠偶聯(lián)，遠(yuǎn)沒(méi)有超過(guò)蛋白A-凝膠（1 mL至少結(jié)合30 mg人IgG）的結(jié)合上限。

IgG的摩爾質(zhì)量為1.5×105g/moL，理想狀態(tài)下每個(gè)抗體分子可以與2 個(gè)抗原分子結(jié)合，那么固載了48.0 ?g抗AFB1單抗的理想柱容量為199.7 ng/0.125 mL變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)膠。實(shí)驗(yàn)測(cè)得的柱容量為105 ng/0.125 mL，即抗體有效利用率為52.6%。因?yàn)榭臻g位阻、熱力學(xué)參數(shù)、反應(yīng)平衡系數(shù)K等原因，即使在溶液中免疫反應(yīng)也無(wú)法達(dá)到每個(gè)抗體分子與2 個(gè)分子抗原結(jié)合的理想狀態(tài)[16]。由于105 ng/0.125 mL的IAC柱已滿足市場(chǎng)需求，制備該親和柱來(lái)評(píng)價(jià)和應(yīng)用。

2.3 親和柱的評(píng)價(jià)

HPLC測(cè)定結(jié)果表明，1.3.2節(jié)中制備的親和柱平均相對(duì)柱容量為105 ng/0.125 mL，需要辛酸-飽和硫酸銨純化單抗48.0 ?g。

當(dāng)免疫親和柱被過(guò)量上樣時(shí)，樣品中的AFB1除可與抗體特異性結(jié)合外，還可與瓊脂糖凝膠基質(zhì)或非抗體蛋白發(fā)生非特異性吸附[23]。因此，甲醇洗脫液中的AFB1是特異性作用和非特異性作用的加和值。而相對(duì)柱容量應(yīng)該只是由抗體引起的吸附量，因此需從實(shí)驗(yàn)得到的加和值中扣除非特異性吸附作用部分。由于無(wú)法在親和柱上直接測(cè)量AFB1的非特異性吸附量，因此制備了蛋白A空白凝膠柱，5 支空白柱平行測(cè)定柱空白為0，說(shuō)明偶聯(lián)載體對(duì)AFB1無(wú)非特異性吸附，以較小的柱體積完成凈化是可行的。

2.4 上樣緩沖液流速的選擇

對(duì)上樣流出液和甲醇洗脫液進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)上樣流速不小于2滴/s時(shí)，樣品中的AFB1有一部分流出，說(shuō)明該流速過(guò)快，使得親和柱內(nèi)的抗體和抗原（AFB1）結(jié)合不充分。在1滴/s、1滴/2 s時(shí)流出液中的均沒(méi)有檢出AFB1，建議上樣流速最快不能超過(guò)1滴/s。

2.5 洗脫液體積及甲醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

由圖2可看出，80%甲醇溶液和100%甲醇的洗脫效果相近，某種程度下可替換100%洗脫；而50%甲醇溶液洗脫明顯不夠，還有50%以上的AFB1尚未洗脫下來(lái)。對(duì)于80%甲醇溶液和100%甲醇的洗脫，1 mL甲醇洗脫率即可達(dá)到95%以上，第2～3毫升基本沒(méi)有AFB1洗脫下來(lái)，考慮到增加洗脫液體積會(huì)引起樣品的稀釋，降低檢測(cè)靈敏度，因此，選擇1 mL純甲醇洗脫液較為合適。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)甲醇的洗脫效果(n=3)Fig.2 Elution of AFB1by different concentrations of methanol (n=3)

2.6 線性關(guān)系

表2 不同質(zhì)量濃度AFB1過(guò)親和柱含量測(cè)定及回收率Table2 Recovery rates of AFB at different initial concentrations after affinity column chromatography

6 組不同質(zhì)量濃度的AFB1過(guò)免疫親和柱后，通過(guò)HPLC法測(cè)定的含量及回收率結(jié)果如表2所示。說(shuō)明該親和柱在高、中、低AFB1含量時(shí)，吸附和洗脫AFB1效果理想。低質(zhì)量濃度（1、5 ng/mL）標(biāo)準(zhǔn)柱回收率均達(dá)到了95%以上，提示對(duì)于低含量樣品凈化時(shí)，親和柱對(duì)AFB1無(wú)截留。

2.7 不同樣品的加標(biāo)回收率

表3 不同樣品的加標(biāo)回收結(jié)果(n=3)Table3 Recoveries of AFB spiked in different samples (n=3)

對(duì)玉米、面粉、花生油、醬油、醋等樣品的加標(biāo)回收結(jié)果見(jiàn)表3。3次重復(fù)平均回收率均在80%以上，CV為3.8%～8.1%。說(shuō)明親和柱適應(yīng)性廣，凈化效率高。

2.8 重復(fù)使用次數(shù)和穩(wěn)定性

使用后的親和柱通過(guò)再生，當(dāng)?shù)?次使用后，親和柱的相對(duì)柱容量從105 ng/0.125 mL凝膠下降至65 ng/0.125 mL凝膠。有實(shí)驗(yàn)[24-25]表明導(dǎo)致IAC柱容量下降的主要因素是洗脫步驟，其次是固定抗體的逸失，貯存時(shí)間和樣品基質(zhì)對(duì)柱容量影響不明顯，因此，純甲醇洗脫后，迅速用70%甲醇溶液除雜質(zhì)后，立即用5～10 倍柱體積PBS緩沖溶液平衡親和柱，有利于保護(hù)親和柱中抗體的活性。圖3顯示，親和柱在2～8 ℃保存前6 個(gè)月，相對(duì)柱容量緩慢下降20%左右，之后6～12 個(gè)月相對(duì)柱容量基本保持穩(wěn)定，12 個(gè)月后相對(duì)柱容量又開(kāi)始緩慢下降。保存12 個(gè)月后，相對(duì)柱容量仍可達(dá)72 ng/0.125 mL凝膠，此時(shí)，通過(guò)減少上樣體積等方法，該親和柱仍可滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖3 親和柱(2～8 ℃貯存)相對(duì)柱容量隨時(shí)間變化曲線(n=3)Fig.3 Relative column capacity of the affinity column as a function of storage time at 2-8 ℃ (n=3)

3 結(jié) 論

以蛋白A-瓊脂糖凝膠為配基定向偶聯(lián)單抗，成功制備了AFB1免疫親和柱。單抗偶聯(lián)率達(dá)98.1%，取48 ?L純化抗體偶聯(lián)，平均相對(duì)柱容量在105 ng/0.125 mL凝膠。柱空白測(cè)試表明蛋白A空白凝膠對(duì)AFB1無(wú)非特異性吸附。不同樣品不同質(zhì)量濃度添加回收實(shí)驗(yàn)表明，較小的柱體積能滿足樣品中AFB1的凈化。

偶聯(lián)時(shí)單抗純度要求不高。從偶聯(lián)后的反應(yīng)液電泳結(jié)果可知，條帶為雜蛋白，且有效單抗全部偶聯(lián)在蛋白A上，揭示該法偶聯(lián)單抗對(duì)其純度沒(méi)有過(guò)高的要求，由于蛋白A對(duì)IgG1有特異性結(jié)合，辛酸-飽和硫酸銨初步純化抗體即可滿足偶聯(lián)要求。

定向偶聯(lián)過(guò)程中單抗有效利用率為52.7%。章英等[17]將純化好的單抗與溴化氰活化的4FF葡聚糖偶聯(lián)制備抗ZEN單克隆抗體免疫親和柱，固載350 ?g ZEN單克隆抗體的容量為0.40 ?g，則抗體的有效利用率為26.93%。從不同偶聯(lián)方法制備真菌毒素親和柱的單抗有效利用率來(lái)比較，蛋白A-凝膠的定向偶聯(lián)是溴化氰活化隨機(jī)偶聯(lián)的1.96 倍。該結(jié)果與黃昕等[26]報(bào)道MG31-r protein A-Sepharose FF的抗原結(jié)合容量是MG31-CNBr-Sepharose 4B抗原結(jié)合容量的1.8 倍結(jié)論相同，說(shuō)明定向偶聯(lián)有助于提高免疫親和吸附劑的抗原結(jié)合容量。定向偶聯(lián)過(guò)程中交聯(lián)條件的優(yōu)化及2 種偶聯(lián)方法制備AFB1免疫親和柱的比較是下一步研究的方向。

為避免重復(fù)使用帶來(lái)雜質(zhì)的干擾和加快分析速度，一次性IAC柱成為期待，但單抗的低效利用及凝膠載體的浪費(fèi)是成本居高不下的主要因素。傳統(tǒng)CNBr活化的瓊脂糖凝膠制備IAC柱時(shí)，凝膠成本占50%，單抗占30%。雖然蛋白A-瓊脂糖凝膠較CNBr活化的瓊脂糖凝膠貴近50%，但是通過(guò)定向偶聯(lián)單抗有效利用率提高了1 倍，且在柱容量不變的情況下IAC柱體積縮減一半，使得制備總成本節(jié)約了近30%。隨著重組蛋白A、單抗等規(guī)?；a(chǎn)，低成本、大容量、一次性IAC柱的使用將變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。

[1] 黃慧明, 徐群英, 胡敏. 黃曲霉毒素檢測(cè)方法研究的概述[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2001, 8(11): 156-158.

[2] STROKA J, ANKLAM E. Development of a simplified densitometer for the determination of aflatoxins by thin-layer chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2000, 904(2): 263-268.

[3] 柳其芳. 酶聯(lián)免疫吸附法和薄層色譜法聯(lián)合分析黃曲霉毒素B1的研究[J]. 中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué), 2006, 6(2): 246-248.

[4] 王坤, 胡驍飛, 王耀, 等. 食品中黃曲霉毒素高靈敏檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生, 2013, 29(7): 1079-1082.

[5] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. GB/T 17480—2008 飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定: 酶聯(lián)免疫吸附法[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[6] SUN Xiulan, ZHAO Xiaolian, TANG Jian, et al. Preparation of gold-labeled antibody probe and its use in immunochromatography assay for detection of aflatoxin B1[J]. International Journal of Food Microbiol, 2005, 99(2): 185-194.

[7] ARDIC M, KARAKAYA Y, ATASEVER M, et al. Determination of aflatoxin B1levels in deep-red ground pepper (isot) using immunoaffinity column combined with ELISA[J]. Food and Chemical Toxicology, 2008, 46(5): 1596-1599.

[8] 孫秀蘭, 張銀志, 湯堅(jiān), 等. 黃曲霉毒素B1完全抗原構(gòu)建中結(jié)合位點(diǎn)研究[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2007, 26(5): 99-103.

[9] 鄧省亮, 賴衛(wèi)華, 許楊. 膠體金免疫層析法快速檢測(cè)黃曲霉毒素B1的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(2): 232-235.

[10] 姜兆興, 劉振偉, 曹旭, 等. 免疫親和柱高效液相色譜法測(cè)定飼料中黃曲霉毒素[J]. 飼料工業(yè), 2007, 28(20): 52-54.

[11] 王桂苓, 邢化冰, 李琳琳, 等. 光化學(xué)柱后衍生-高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉中的黃曲霉毒素B1[J]. 化學(xué)分析計(jì)量, 2014, 23(3): 28-31.

[12] 李友平, 黃艷偉, 劉彬彬, 等. 柱后光化學(xué)衍生-HPLC法檢測(cè)藥材中黃曲霉毒素[J]. 分子科學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 30(3): 226-231.

[13] 黃飚, 陶文沂, 張蓮芬, 等. 黃曲霉毒素B1的高靈敏度時(shí)間分辨熒光免疫分析[J]. 核技術(shù), 2006, 29(4): 295-300.

[14] 王勇, 陳定虎, 張憲臣, 等. 免疫親和層析凈化熒光光度法快速檢測(cè)雞飼料中黃曲霉毒素[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2013(11): 62-64.

[15] 徐燕, 王云, 張勛, 等. 去氫甲睪酮多克隆抗體免疫親和柱的制備研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2011, 11(7): 195-199.

[16] 王迪, 楊曙明, 劉瀟威, 等. 萊克多巴胺免疫親和柱的制備與應(yīng)用研究[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2010, 29(8): 812-816.

[17] 章英, 黃志兵, 鄧舜洲, 等. 抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體免疫親和柱的制備研究[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 41(2): 110-113.

[18] 李金鎖, 邱月明, 王超. 獸藥殘留分析[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2002: 214.

[19] CHU F S, UENO I. Production of antibody against aflatoxin B1[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1977, 33(5): 1125-1128.

[20] 梁榮, 伊嵐, 李健強(qiáng). 小鼠IgG類單克隆抗體三種純化方法的比較[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 1996, 12(1): 55-58.

[21] 張權(quán)庚, 張玉祥, 丁衛(wèi), 等. 抗體制備與使用實(shí)驗(yàn)指南[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2010: 109-111.

[22] SISSON T H, CASTOR C W. An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose[J]. Journal of Immunological Methods, 127: 215-220.

[23] 張秀莉. 免疫親和萃取-LC-MS聯(lián)用技術(shù)在痕量農(nóng)殘分析中的應(yīng)用研究[D]. 大連: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 2006: 93-96.

[24] 趙麗元, 郝愛(ài)魚(yú), 劉英慧. 黃曲霉毒素免疫親和柱重復(fù)利用的探討[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用, 2014, 8(1): 37-39.

[25] 胡桂林, 趙源, 王志萍, 等. 大麥中赭曲霉毒素A的檢測(cè)及免疫親和柱重復(fù)使用的研究[J]. 中國(guó)食品工業(yè), 2009(4): 48-49.

[26] 黃昕, 邱宗蔭. 免疫親和色譜定向偶聯(lián)方法的研究[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 24(2): 132-134.

Preparation of Immunoaffinity Column for AFB1with Monoclonal Antibodies Immobilized on Protein A-Sepharose

GONG Yan1, YANG Tingting1, MO Xiaosong2, ZHANG Haitao1, HUANG Wei2, LU Tingjin1, ZHANG Dongsheng1,*, WANG Haifeng3
(1. Jiangsu Suwei Institute of Microbiology Co. Ltd., Wuxi 214063, China; 2. Grain and Oil Quality Monitoring Bureau of Grain in Jiangsu Province, Nanjing 210011, China; 3. College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210011, China)

The immunoaffinity column (IAC) for aflatoxin B1(AFB1) was prepared by directed coupling of protein A-sepharose with the anti-AFB1monoclonal antibody which was preliminarily purifi ed by caprylic acid-ammonium sulfate method. The results showed that the concentration, purity and antibody subtype of the purifi ed monoclonal antibody were 17.5 mg/mL, 45.1% and IgG1,respectively. When coupling 48 ?L of purifi ed antibody with protein A-sepharose, and the coupling rate was 98.1%. The average relative column capacity and column blank were 105 ng/0.125 mL gel and 0, respectively. The average recoveries of standard addition in different samples (corn fl our, wheat fl our, peanut oil, soy sauce) were all above 80%. After being stored at 2–8 ℃ for 12 months, the relative capacity of the IAC was 72 ng/0.125 mL gel. These results show that the anti-AFB1affi nity column prepared by this method has large relative capacity and good stability which meet the requirement for separation and purifi cation of AFB1from real samples.

afl atoxin B1; protein A-sepharose; directed coupling; immunoaffi nity column

O657

A

10.7506/spkx1002-6630-201510043

2014-09-26

無(wú)錫市農(nóng)業(yè)科技支撐項(xiàng)目(CLE02N1405)

龔燕(1974—),女,副研究員,學(xué)士,研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：526137895@qq.com

*通信作者：張東升(1975—),男,副研究員,學(xué)士,研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：zds0127@sina.com