劉勤勤，朱科學，郭曉娜，彭 偉，周惠明*

（江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

茶多酚與大豆分離蛋白的相互作用

劉勤勤，朱科學，郭曉娜，彭 偉，周惠明*

（江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

利用熒光光譜、紫外-可見光譜和傅里葉變換紅外光譜法，研究茶多酚與大豆分離蛋白之間的相互作用。結(jié)果表明：茶多酚對大豆分離蛋白有較強的熒光猝滅作用且為靜態(tài)猝滅，其中，茶多酚與大豆分離蛋白在291、298、310 K時相互作用的表觀結(jié)合常數(shù)分別為4.571×105、2.955×105、2.672×105L/mol，對應的結(jié)合位點數(shù)分別為1.316、1.299、1.286。熱力學數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明：茶多酚與大豆分離蛋白反應的作用力主要是范德華力和氫鍵作用；同步熒光光譜和紫外-可見光譜表明茶多酚改變了芳香氨基酸殘基在空間結(jié)構(gòu)中所處的微環(huán)境，使大豆分離蛋白的分子構(gòu)象發(fā)生改變，且同步熒光光譜顯示茶多酚與大豆分離蛋白中色氨酸殘基發(fā)生相互作用，使其周圍的疏水作用減少。傅里葉變換紅外光譜表明茶多酚引起大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

茶多酚；大豆分離蛋白；熒光光譜；紫外-可見光譜；傅里葉變換紅外光譜

茶是世界上最受歡迎的飲料之一，擁有多種保健功效，如抗氧化、抗癌、抑菌等，其主要活性成分為茶多酚。茶多酚又名茶單寧、茶鞣質(zhì)，是茶葉中所含的一類多羥基酚類化合物的總稱，占綠茶干質(zhì)量的15%～30%[1]。

近年來，人們喜歡把茶添加到牛奶中制備奶茶，因為牛奶可以改善茶的感官特性，降低多酚引起的收斂性[2]，但同時茶的抗氧化性和蛋白質(zhì)的功能特性也發(fā)生了變化，故學者主要著眼于在分子水平上研究茶多酚與牛奶蛋白的相互作用[3-5]。如今，由于大豆蛋白的營養(yǎng)價值與動物蛋白等同，且不含膽固醇，極適宜婦女及老年人食用，故逐漸有人用豆奶替代牛奶制備奶茶，不僅成本低、營養(yǎng)豐富，而且還可以滿足乳糖不耐癥患者的需求。郭興鳳等[6]報道了茶多酚對大豆分離蛋白功能性質(zhì)的影響，茶多酚可以提高大豆分離蛋白的起泡性及乳化性。Ryan等[7]研究了不同豆奶對不同紅茶抗氧化性的影響。然而目前從分子水平研究茶多酚與大豆分離蛋白相互作用的報道相對較少。

本實驗運用熒光光譜、紫外-可見光譜和傅里葉變換紅外光譜，詳細研究茶多酚與大豆分離蛋白相互作用之間的表觀結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、作用力等重要信息，為了解茶多酚與大豆分離蛋白的結(jié)合方式，以及茶多酚在大豆制品中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

茶多酚（tea polyphenols，TP），純度＞90%，購自無錫太陽綠寶科技有限公司；大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI），蛋白質(zhì)含量92.04%，購自谷神生物科技集團有限公司。

實驗中所用試劑均為分析純；所用水為去離子水。

1.2儀器與設(shè)備

UV-1800分光光度計、F-7000型熒光分光光度計日本Shimadzu公司；傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；電磁攪拌器 上海司樂儀器有限公司；恒溫水浴鍋 金壇市岸頭國瑞實驗儀器廠；pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1溶液配制

茶多酚溶液：將茶多酚用去離子水溶解，配制成3.2 mg/mL的溶液，實驗時稀釋至所需質(zhì)量濃度。

大豆分離蛋白溶液：用pH值為7.5的緩沖液溶解大豆分離蛋白，磁力攪拌2 h，配制成0.5 mg/mL的溶液備用。

1.3.2熒光光譜分析

向4 mL大豆分離蛋白溶液（0.5 mg/mL）中逐滴加入50μL不同質(zhì)量濃度的茶多酚溶液，充分混合后，分別在18、25、37℃的恒溫水浴鍋中保溫5 min。選擇激發(fā)波長為280 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm、掃描速率為12 000 nm/min，于F-7000熒光光譜儀的1 cm石英比色池中掃描300～500 nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜。樣品的同步熒光光譜測定條件如下：室溫條件下，分別固定Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm，進行同步熒光光譜掃描。

1.3.3紫外-可見光譜分析

移取4 mL 0.5 mg/mL的大豆分離蛋白溶液于石英比色池中，掃描250～350 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜。掃描完畢后，加入50μL不同質(zhì)量濃度的茶多酚溶液到含有大豆分離蛋白液的比色池中，混勻，放置5 min后掃描吸收光譜。以相同質(zhì)量濃度的大豆分離蛋白溶液作空白，記錄大豆分離蛋白溶液的紫外-可見吸收差譜。

1.3.4傅里葉變換紅外光譜分析

將大豆分離蛋白溶液和大豆分離蛋白溶液與茶多酚的混合溶液（大豆分離蛋白溶液質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，茶多酚質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL）冷凍干燥，按樣品粉末與溴化鉀粉末1∶100（m/m）的比例混合，研細均勻后，置于模具中壓片，在32 cm-1的分辨率條件下掃描32次，4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描紅外光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1茶多酚與大豆分離蛋白相互作用的熒光光譜

2.1.1茶多酚質(zhì)量濃度對大豆分離蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)分子存在色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，因為其含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)或共軛雙鍵，在一 定的激發(fā)波長下能夠產(chǎn)生熒光，故蛋白質(zhì)具有內(nèi)源熒光[8]。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸具有不同的生色基團，因而具有不同的熒光光譜，分別會在348、303、282 nm波長處出現(xiàn)熒光峰。在天然蛋白質(zhì)分子中苯丙氨酸熒光極弱，對熒光有貢獻的只有酪氨酸和色氨酸[9]。在280 nm激發(fā)波長下，大豆分離蛋白的最大發(fā)射波長為353 nm，在303 nm波長處未見熒光峰的形成，而茶多酚本身的熒光發(fā)射信號非常弱，對大豆分離蛋白熒光信號的干擾可以忽略，因此本研究中不用考慮“內(nèi)濾光效應”的干擾問題。茶多酚與大豆分離蛋白作用的熒光光譜見圖1。

圖1 TP對SPI熒光光譜的影響Fig.1 Effect of TP on the fluorescence of SPI

由圖1可知，茶多酚對大豆分離蛋白的熒光具有明顯的猝滅作用，在一定質(zhì)量濃度大豆分離蛋白溶液條件下，隨著茶多酚質(zhì)量濃度的增加，大豆分離蛋白的熒光逐漸被猝滅。茶多酚使得大豆分離蛋白的最大發(fā)射峰紅移，從353 nm處紅移至362 nm，大約紅移9 nm，這表明茶多酚與大豆分離蛋白可能發(fā)生相互作用，使大豆分離蛋白分子的空間構(gòu)象發(fā)生了變化，進而使色氨酸周圍的微環(huán)境由疏水性環(huán)境向親水性環(huán)境發(fā)生轉(zhuǎn)變，肽鏈變得更加伸展[10]。

2.1.2茶多酚-大豆分離蛋白復合物的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及作用力

熒光猝滅有多種作用機理，通?？煞譃閯討B(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[11]。動態(tài)猝滅表現(xiàn)為溫度的升高將增加離子有效碰撞的數(shù)目，加劇電子的轉(zhuǎn)移，使熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而增大；靜態(tài)猝滅則主要是熒光分子與生物活性小分子形成復合物，從而使熒光物質(zhì)的熒光發(fā)生猝滅，且隨著溫度升高，復合物的穩(wěn)定性下降，故而熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)減小。因此，可根據(jù)不同溫度條件下兩者相互作用的結(jié)果來幫助判定猝滅機制[12]。

在研究蛋白質(zhì)-多酚的相互作用時，可利用Stern-Volmer方程對其所涉及的猝滅類型進行判斷[13]：

式中：F0和F分別是未加入和加入茶多酚時大豆分離蛋白溶液的熒光強度；[Q]為茶多酚的總濃度/（mol/L）；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s）），Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol），Kq＝Ksv/τ0，各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大猝滅常數(shù)約為2.0×1010L/（mol·s）；τ0為猝滅劑不存在時熒光體的壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s[14]。

根據(jù)Stern-Volmer方程，以[Q]為自變量，F(xiàn)0/F為因變量，通過線性擬合得圖2，由圖中直線的斜率和τ0可得到不同溫度條件下茶多酚與大豆分離蛋白相互作用的Ksv和Kq，結(jié)果見表1。

圖2 不同溫度條件下TP猝滅SPI的Stern-Volmeerr圖Fig.2 Stern-Volmer plots of SPI quenched by TP at different temperatures

表1 TP-SPI復合物的熒光猝滅常數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table1 Quenching rate constants and correlation coefficients of SPI andd TTPP

以上結(jié)果表明，茶多酚對大豆分離蛋白的Stern-Volmer曲線均呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，且隨著溫度的升高，大豆分離蛋白的Stern-Volmer曲線斜率呈現(xiàn)不斷減小的趨勢，即靜態(tài)猝滅常數(shù)下降，這說明茶多酚對大豆分離蛋白的熒光猝滅機制屬于靜態(tài)猝滅。對于生物大分子，各類猝滅劑由擴散碰撞產(chǎn)生的最大猝滅常數(shù)為2×1010L/（mol·s）[15]，顯然，茶多酚對大豆分離蛋白的熒光猝滅速率均比擴散控制的Kq大，這進一步說明它們的猝滅過程是分子之間結(jié)合形成化合物所引起的靜態(tài)猝滅，而不是由分子擴散和碰撞所引起的動態(tài)猝滅。

對于靜態(tài)猝滅，可采用下式計算結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點數(shù)n[16]：

式中：F和F0分別表示有和無猝滅劑時熒光體的熒光強度；KA為表觀結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點數(shù)；[Q]為猝滅劑的濃度/（mol/L）。

按公式（2），以lg[（F0-F）/F]對lg[Q]作圖，曲線經(jīng)線性擬合得圖3，可計算出不同溫度條件下茶多酚與大豆分離蛋白相互作用的表觀結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點數(shù)n（表2）。這表明茶多酚與大豆分離蛋白在291、298、310 K這3個溫度點都存在著強烈的相互作用，均形成了結(jié)合位點數(shù)接近于1的復合物，且隨溫度的變化不明顯。

表2 TP-SPI復合物的結(jié)合位點數(shù)、表觀結(jié)合常數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table2 Apparent binding constants, binding sites numbers and correlation coefficients of SPI and TP

當溫度相差不大時，結(jié)合反應的焓變可視為常數(shù)[17]，可由van’t Hoff方程判定茶多酚與大豆分離蛋白之間的作用力類型。

式中：R為氣體狀態(tài)常數(shù)，8.314 J/（K·mol）；T為實驗溫度/K；K為相應溫度下反應體系的結(jié)合常數(shù)/（L/mol）。

由式（3）、（4）計算出的熱力學參數(shù)見表3。

表3 TP與SPI結(jié)合的相關(guān)熱力學參數(shù)Table3 Thermodynamic parameters for interaction between TP and SPITable3 Thermodynamic parameters for interaction between TP and SPI

生物活性小分子和生物大分子之間的作用力主要包括氫鍵、范德華力、疏水作用及靜電作用4種類型：

1）若ΔH＞0、ΔS＞0，則主要是疏水作用；2）若ΔH＜0、ΔS＜0，則主要是范德華力和氫鍵作用；3）若ΔH＜0、ΔS＞0，則是靜電作用[18]，故可根據(jù)熵變（ΔS）和焓變（ΔH）判定兩者的作用方式[19]。由表3可知，ΔG＜0，說明茶多酚與大豆分離蛋白的結(jié)合可以自發(fā)進行。該反應的ΔH＜0，表明茶多酚與大豆分離蛋白之間的相互作用為放熱反應，降溫有利于反應的進行，這與結(jié)合常數(shù)KA隨著溫度的升高而逐漸降低相吻合。由體系的ΔH＜0和ΔS＜0可說明茶多酚與大豆分離蛋白之間的作用力主要是范德華力和氫鍵。

2.2茶多酚對大豆分離蛋白構(gòu)象的影響

2.2.1茶多酚與大豆分離蛋白相互作用的同步熒光光譜

同步熒光光譜法是一種廣泛應用的通過測量發(fā)射波長偏移來研究氨基酸殘基微環(huán)境的方法，能夠反映出茶多酚對大豆分離蛋白構(gòu)象的影響。固定激發(fā)和發(fā)射單色器的波長差（Δλ），以固定的Δλ得到同步熒光光譜，從而獲得關(guān)于生色團分子周圍環(huán)境的信息。當Δλ＝15 nm時，只顯示酪氨酸殘基的特征熒光光譜；當Δλ＝60 nm時，只顯示色氨酸殘基的特征熒光光譜，由此可判斷大豆分離蛋白中酪氨酸殘基和色氨酸殘基微環(huán)境的極性變化[20]。

圖4 TP-SPI體系的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of TP-SPI at room temperature

由圖4可知，隨著茶多酚質(zhì)量濃度的增加，大豆分離蛋白中酪氨酸殘基（Δλ＝15 nm）和色氨酸殘基（Δλ＝60 nm）的特征熒光吸收峰不斷猝滅，Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm的最大發(fā)射峰均有紅移，表明加入茶多酚后，大豆分離蛋白中色氨酸和酪氨酸附近的微環(huán)境有所改變，親水性增加。該現(xiàn)象表明大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變化。色氨酸最大發(fā)射峰紅移7 nm（從285 nm紅移至292 nm）（圖4B），酪氨酸最大發(fā)射峰紅移2 nm（從293 nm紅移至295 nm）（圖4A），說明茶多酚與大豆分離蛋白作用的結(jié)合位點更接近于色氨酸殘基[21]。

2.2.2茶多酚與大豆分離蛋白相互作用的紫外-可見吸收光譜

紫外-可見光譜廣泛應用于小分子與生物大分子作用的研究中。一般來說，峰的強度變化大小是兩者相互作用強弱的標志，而峰位的改變通常認為是蛋白質(zhì)大分子疏水氨基酸殘基微環(huán)境變化引起構(gòu)象變化導致的。

大多數(shù)蛋白質(zhì)分子由于色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）等氨基酸中芳香雜環(huán)對光的吸收，故在270 nm波長附近有一個吸收峰。蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸殘基所處微環(huán)境發(fā)生改變，會引起蛋白質(zhì)吸收波長變化，因而可以利用蛋白質(zhì)的紫外-可見吸收光譜初步探討蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[22-23]。

圖5 不同質(zhì)量濃度TP對SPI溶液紫外-可見吸收光譜的影響Fig.5 Effect of TP concentration on the UV-Vis absorption spectrum of SPI

圖5顯示了不同質(zhì)量濃度茶多酚對大豆分離蛋白紫外-可見吸收光譜的影響。從圖中可以看出，隨著茶多酚質(zhì)量濃度增加，大豆分離蛋白的紫外-可見吸收光譜峰值依次升高，并且發(fā)生藍移，最大吸收峰波長由279 nm藍移至275 nm，說明茶多酚誘導大豆分離蛋白分子肽鏈伸展，使得深埋在大豆分離蛋白分子內(nèi)部酪氨酸殘基和色氨酸殘基中的芳香雜環(huán)疏水基團裸露出來，造成了大豆分離蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，進而增強了吸光度。這種構(gòu)象的改變更有利于大豆分離蛋白分子中色氨酸殘基和酪氨酸殘基中芳香雜環(huán)的π-π*躍遷[24]。

2.2.3茶多酚與大豆分離蛋白相互作用的傅里葉變換紅外光譜

通過紅外光譜來進一步考察蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶在1 700～1 600 cm-1范圍內(nèi)（主要是C＝O伸縮振動）有吸收；酰胺Ⅱ帶在1 600～1 500 cm-1范圍內(nèi)（主要是C—N伸縮振動和N—H彎曲振動）有吸收[25]。酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶紅外吸收峰的變化反映了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。由圖6可知，茶多酚的加入引起了大豆分離蛋白酰胺Ⅰ帶從1 654.62 cm-1藍移至1 649.42 cm-1，酰胺Ⅱ帶從1 538.92 cm-1藍移至1 519.83 cm-1，說明茶多酚引起了大豆分離蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化。

圖6 SPI和SPI-TP的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.6 Fouriertransform infrared spectra of SPI and SPI-TP

3 結(jié) 論

茶多酚與大豆分離蛋白之間有較強的相互作用，范德華力和氫鍵作用是其主要作用力；且兩者相互作用引起大豆分離蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。同步熒光光譜和紫外-可見光譜表明茶多酚能改變芳香氨基酸殘基在空間結(jié)構(gòu)中所處的微環(huán)境，使大豆分離蛋白分子的構(gòu)象發(fā)生改變，且同步熒光光譜顯示茶多酚與大豆分離蛋白中色氨酸殘基發(fā)生相互作用，使其周圍的疏水作用減少。傅里葉變換紅外光譜表明茶多酚引起大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

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Spectroscopic Analysis of Interaction between Tea Polyphenol and Soy Protein Isolate

LIU Qinqin, ZHU Kexue, GUO Xiaona, PENG Wei, ZHOU Huiming*
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The interaction between tea polyphenol and soy protein isolate was studied by fluorescence, ultraviolet-visible (UV-Vis) and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopies. The results suggested that tea polyphenol had a strong ability to quench the fluorescence of soy protein isolate in a static mode. The binding constants (KA) and site numbers (n) obtained at different temperatures were 4.571×105L/mol, 1.316 (291 K); 2.955×105L/mol, 1.299 (298 K); and 2.672×105L/mol, 1.286 (310 K), respectively. According to the thermodynamic parameters, van der Waals force and hydrogen bond played a dominant role in the interaction between tea polyphenol and soy protein isolate. The synchronous fluorescence and UV-Vis spectra showed that tea polyphenol changed the microenvironment of the aromatic amino acid residues in the space structure and the conformation of soy protein isolate. The synchronous fluorescence spectra also revealed that tea polyphenol interacted with tryptophan residues in soy protein isolate, and the vicinity of tryptophan residues was less hydrophobic. The FTIR spectra revealed that secondary structure of soy protein isolate was changed by tea polyphenol.

tea polyphenol; soy protein isolate; fluorescent spectroscopy; ultraviolet-visible spectroscopy; Fourier transform infrared spectroscopy

TS201

1002-6630（2015）17-0043-05

10.7506/spkx1002-6630-201517009

2014-10-16

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD36B06）

劉勤勤（1987—），女，碩士研究生，研究方向為主食與方便食品。E-mail：annie_1115@yeah.net

*通信作者：周惠明（1957—），男，教授，博士，研究方向為主食與方便食品。E-mail：hmzhou@jiangnan.edu.cn