石 印，賈夢雪，狄 瑋，劉 燕

（花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室，國家花卉工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，北京100083）

超低溫保存（Cryopreservation）是指將植物材料活體，采取一定的技術(shù)，安全存入-196℃液氮中長期保存，需要時采取一定的方法使之回到常溫并正常生長的一整套生物技術(shù)［1］。超低溫保存已經(jīng)成功應(yīng)用在100多種植物上，相對于保存技術(shù)的研究，其保存機制的研究尚不成熟［2］，而機制的研究對于回答為何一些植物未能實現(xiàn)超低溫保存有重要意義。

近年來，越來越多的動物超低溫保存研究表明，超低溫保存失敗可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。甘藍［3］、公羊精子［4］和豬精子［5］等在超低溫保存后都出現(xiàn)了氧化應(yīng)激現(xiàn)象?；钚匝酰≧OS）在細胞中有一定積極作用，是很多細胞器正常生理反應(yīng)過程中可能產(chǎn)生的副產(chǎn)物［6-7］，但一旦過量，相應(yīng)的清除機制如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等酶類和抗壞血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）、維生素E、脯氨酸等非酶類物質(zhì)，會清除多余的活性氧［8］。當(dāng)活性氧生成與清除系統(tǒng)之間失衡，過多的活性氧會對細胞造成損傷而發(fā)生所謂的氧化應(yīng)激。活性氧攻擊的主要目標(biāo)是膜脂，主要通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)達到破壞質(zhì)膜的目的，其中丙二醛（MDA）是重要的產(chǎn)物。目前，植物超低溫保存中有關(guān)活性氧的研究尚不多，僅在百合花粉超低溫保存中有所涉及［9］。

本研究以2個芍藥（Paeonia lactiflora）品種的花粉為材料，研究了新鮮花粉在液氮凍存前后活性氧和抗氧化物的變化，旨在探索超低溫保存花粉活力變化與活性氧的關(guān)系，探明芍藥花粉超低溫保存中是否存在氧化應(yīng)激現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 材料

芍藥‘大紅赤金'和‘紫鳳朝陽'的花粉均取自山東菏澤的曹州牡丹園內(nèi)。于4月下旬采集當(dāng)天開放的芍藥花藥，放入硫酸紙袋帶回實驗室將花藥晾在硫酸紙盒上，自然晾干1d，過細孔篩篩出花粉備用。

1.2 方法

1.2.1 花粉萌發(fā)試驗 采用懸滴法［10-11］。將花粉懸于15%蔗糖+0.1%硼酸的培養(yǎng)液中，在25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后于顯微鏡下統(tǒng)計萌發(fā)數(shù)。以花粉管長度超過花粉粒直徑2倍記為萌發(fā)。每個品種重復(fù)4次，每個重復(fù)隨機抽取3個視野。萌發(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)／總花粉數(shù)×100%。

1.2.2 花粉超低溫保存 將花粉置于凍存管中，直接投入液氮。10d后取出，立即于25℃水中化凍1～2min，取出花粉測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 生理指標(biāo)測定

1.2.3.1 ROS含量測定 采用熒光染色法［12］。乙醇溶解的 DCFH-DA（2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽）探針母液用PBS稀釋到100μmol／L，每0.01g花粉加入200μL DCFH-DA溶液，37℃避光水浴對花粉懸浮液進行孵育，每個品種重復(fù)3次。避光孵育30min后取出花粉在黑暗條件下用PBS洗滌3次，然后用流式細胞儀檢測熒光，激發(fā)光為488nm，發(fā)射光為525nm，每個樣品測定10 000個花粉的熒光值，并取未染色的花粉作為陰性對照，實際熒光值=樣品熒光值-陰性對照值。

1.2.3.2 酶活性測定 取花粉0.05g，用0.05 mol／L磷酸緩沖液（pH 7.8）冰浴研磨至勻漿，定容到1mL，4℃下10 000r·min-1離心15min，上清液即為酶待測液。SOD活性測定參照李合生的NBT法［13］。反應(yīng)后用分光光度計測定560nm處的吸光度值，以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位，換算出酶活性。每個品種重復(fù)3次，取均值。CAT活性測定參照紫外分光光度法進行改進［14］。加入反應(yīng)體系后用紫外分光光度計測定240 nm處吸光度值，每30min讀數(shù)1次，共測3min。以1min內(nèi)減少0.1的酶量為1個酶活性單位換算出酶活性。每個品種重復(fù)3次，取均值。

1.2.3.3 MDA含量測定 MDA含量參照硫代巴比妥酸法［13］進行改進。取0.03g花粉用10%三氯乙酸溶液研磨并定容至1.5mL，10 000r·min-1離心10min后取上清800μL，加入等量0.6%硫代巴比妥酸溶液沸水浴30min，轉(zhuǎn)移至冰上冷卻5min，用分光光度計測定450、532nm和600nm處的吸光度值，換算出MDA含量。每個品種重復(fù)3次，取均值。

1.2.3.4 AsA含量測定 提取方法與MDA相同，反應(yīng)體系參照陳建勛［14］等的方法，然后用分光光度計測定525nm處的吸光度值，根據(jù)制作的標(biāo)準曲線確定抗壞血酸濃度。每個品種重復(fù)3次，取均值。

1.2.3.5 相對電導(dǎo)率測定 采用尚曉倩［15］的方法。取0.05g花粉溶于10mL蒸餾水，靜置4h，煮沸15min。用電導(dǎo)率儀測定煮沸前后的電導(dǎo)率，以其比值即相對電導(dǎo)率作為評價標(biāo)準。每個品種重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 本研究數(shù)據(jù)使用Excel 2010處理、繪圖，結(jié)果用均值±標(biāo)準誤表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，以Duncan法進行差異顯著性分析，顯著水平p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 液氮凍存前后花粉萌發(fā)率的變化

花粉萌發(fā)率是花粉活力最直接的表現(xiàn)，液氮凍存前2個品種的萌發(fā)率如圖1所示。這2個品種經(jīng)液氮凍存前后的表現(xiàn)不同，‘大紅赤金'花粉萌發(fā)率下降而‘紫鳳朝陽'無顯著變化。

2.2 液氮凍存后花粉細胞丙二醛和電導(dǎo)率變化

當(dāng)細胞的脂質(zhì)過氧化程度增加時，作為一種重要的產(chǎn)物，細胞內(nèi)的MDA會有所增加。膜損傷的另一個標(biāo)志的電導(dǎo)率的上升。液氮保存前后2個品種的花粉細胞MDA含量和相對電導(dǎo)率變化見圖2。

對于同一個品種，MDA含量和相對電導(dǎo)率變化趨勢是一致的，‘大紅赤金'這2個值均在液氮保存后顯著增加，而‘紫鳳朝陽'在液氮凍存前后無顯著差異。

圖1 液氮凍存前后花粉的萌發(fā)率變化Fig.1 Germination rate changes of pollen before and after LN2storage

圖2 液氮凍存前后花粉的膜損傷程度Fig.2 Membrane damage of pollen before and after LN2storage

2.3 液氮凍存前后花粉ROS水平的變化

ROS水平直接反應(yīng)了花粉細胞內(nèi)的氧化還原水平，ROS水平過高會對細胞產(chǎn)生損傷［8］。這2個品種的ROS水平在保存前后均無顯著差異（圖3）。

圖3 液氮凍存前后花粉的ROS水平變化Fig.3 ROS level changes of pollen before and after LN2storage

2.4 液氮凍存前后花粉抗氧化酶活性的變化

SOD是一種高效率的ROS清除酶，是阻止ROS的毒害作用的第一道防線［16］，CAT的作用主要是清除細胞內(nèi)的過氧化氫［16］，本研究中液氮保存前后2種酶的活性變化見圖4。2個品種2種抗氧化酶變化一致，液氮保存后均顯著高于保存前的活性，且‘紫鳳朝陽'2種酶活性變化高于‘大紅赤金'。

2.5 液氮凍存前后花粉AsA含量的變化

AsA是植物中含量最豐富的、最有力的水溶性抗氧化劑，可以阻止或減輕ROS引起的損傷。液氮凍存前后花粉的AsA含量變化見圖5。2個品種表現(xiàn)不同，液氮保存前后‘大紅赤金'的AsA含量無顯著差異，而‘紫鳳朝陽'在液氮保存后AsA含量明顯提高。

3 結(jié)論與討論

各種非生物脅迫都有可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，并往往伴隨著ROS的變化。ROS的變化會引起抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)，包括酶促和非酶促反應(yīng)。SOD和CAT等屬于酶促反應(yīng)中重要的酶。在各種脅迫下，ROS清除系統(tǒng)都可能會對脅迫做出反應(yīng)。對野牛草幼苗進行低溫處理，葉片中SOD和CAT活性上升，隨著處理時間延長，酶活性下降，活性氧過量使其與防御系統(tǒng)的動態(tài)平衡遭到破壞［17］。低溫脅迫下，紅松幼苗針葉中屬于ROS的超氧陰離子和過氧化氫含量均先上升后下降，而SOD和CAT活性均下降［18］。干旱脅迫下，對干旱敏感的小麥幼苗葉片中ROS含量高于抗旱品種，且抗氧化酶活性更低［19］。在不同環(huán)境脅迫下，陸生黃槿、許樹、蓮葉桐等陸生半紅樹植物的各種抗氧化酶活性均上升，而氧自由基產(chǎn)生速率較低時抗氧化酶活性未上升［20］。可見，ROS的上升和植物活性的下降往往伴隨著抗氧化酶活性的降低。而在本研究中，2種花粉的這2種抗氧化酶活性均上升，ROS未明顯上升，可能是抗氧化酶起到一定的清除作用。

圖4 液氮凍存前后花粉的抗氧化酶活性變化Fig.4 Antioxidative enzyme activity changes of pollen before and after LN2storage

圖5 液氮凍存前后花粉的ASA含量變化Fig.5 ASA content changes of pollen before and after LN2storage

非酶促反應(yīng)中重要的一環(huán)是抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)，其中涉及的物質(zhì)除了相關(guān)酶類以外，更重要的是源源不斷地產(chǎn)生抗氧化能力強的非酶類物質(zhì)，如ASA和GSH。內(nèi)源性ASA可由循環(huán)中的單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）和脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）產(chǎn)生［21］，同時維持著循環(huán)內(nèi)的酶促反應(yīng)［16］，外源性ASA也證明了其減輕超低溫損傷的作用［22-23］。超低溫保存相關(guān)研究中，青花菜在長期液氮保存后ASA含量有所下降［3］。本研究萌發(fā)率變化不一致的2個品種ASA含量變化不一致：凍存后萌發(fā)率下降的‘大紅赤金'的ASA含量無顯著增加，而凍存前后萌發(fā)率無差異的‘紫鳳朝陽'ASA含量凍后上升，故對于芍藥花粉來說，ASA的抗氧化作用可能對萌發(fā)率有著更為關(guān)鍵的影響，還有待進一步研究。

以上結(jié)果揭示，保存前后芍藥花粉ROS含量沒有顯著差異，并不意味著液氮保存過程中ROS含量始終沒有變化，因為MDA含量和相對電導(dǎo)率的升高可以揭示細胞膜的氧化傷害［24］，但是有的品種通過體內(nèi)SOD、CAT和AsA作用，有效地清除多余的ROS，重新達到氧化平衡狀態(tài)，ROS沒有對細胞膜造成嚴重傷害，如‘紫鳳朝陽'，因此最終花粉萌發(fā)率沒有受到影響；有的品種未能實現(xiàn)氧化平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生，細胞膜被嚴重氧化、膜透性增加，液氮保存后花粉萌發(fā)率下降，如‘大紅赤金'。

本研究表明，超低溫保存中氧化應(yīng)激是否發(fā)生，不能以體內(nèi)ROS絕對含量或液氮保存前后是否變化進行判斷。氧化應(yīng)激的發(fā)生會導(dǎo)致花粉活力下降。因此，超低溫保存中ROS及其清除系統(tǒng)的相互作用值得進一步研究，尤其是非酶促抗氧化劑在其中所起的作用。

［1］ 劉燕，周慧，方標(biāo).園林花卉種子超低溫保存研究［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001（4）：39-44.LIU Y，ZHOU H，F(xiàn)ANG B.Cryopreservation of seeds of ornamental plants［J］.Journal of Beijing Forestry University，2001（4）：39-44.（in Chinese）

［2］ 徐瑾，劉芊，李秉玲，等.超低溫保存中的氧化應(yīng)激和細胞凋亡［J］.中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2013（4）：543-548.XU J，LIU Q，LI B L，et al.Oxidative stress and apoptosis with cryopreservation［J］.Chinese Journal of Cell Biology，2013（4）：543-548.（in Chinese）

［3］ RASEETHA S.Understanding the degradation of ascorbic acid and glutathione in relation to the levels of oxidative stress biomarkers in broccoli（Brassica oleracea L.italica cv.bellstar）during storage and mechanical processing.［J］.Food Chemistry，2013，138：2-3.

［4］ SICHERLE C C.Lipid peroxidation and generation of hydrogen peroxide in frozen-thawed ram semen supplemented with catalase or Trolox［J］.Small Ruminant Research，2011，95（2-3）：144-149.

［5］ 武彩紅，黃秀明，周春寶，等.超低溫保存對豬精子膜完整性及氧化應(yīng)激水平的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（11）：221-222.

［6］ DEL RIO L A.Reactive oxygen species and reactive nitrogen species in peroxisomes.production，scavenging，and role in cell signaling［J］.Plant Physiology，2006，141：330-335.

［7］ NAVROT N.Reactive oxygen species generation and antioxidant systems in plant mitochondria［J］.Physiologia Plantarum，2007，129：185-195.

［8］ FOYER C H，G NOCTOR.Redox homeostasis and antioxidant signaling：A metabolic interface between stress perception and physiological responses［J］.Plant Cell，2005，17（7）：1866-1875.

［9］ JIN X，L QIAN，et al.Generation of reactive oxygen species during cryopreservation may improve Lilium x Siberia pollen viability［J］.In Vitro Cellular &Developmental Biology Plant，2014，50（3）：369-375.

［10］ 李秉玲.芍藥屬植物超低溫保存花粉的差異表達蛋白質(zhì)研究及花粉庫的建立［D］.北京：北京林業(yè)大學(xué)，2010.

［11］ 王玲，祝朋芳，毛洪玉.不同培養(yǎng)基及不同貯藏條件對金娃娃萱草花粉生命力的影響［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，2009（3）：95-97，108.WANG L，ZHU P F，MAO H Y.Viability of the pollen of Hemerocallis hybridus under different media and store conditions［J］.Journal of Northwest Forestry University，2009（3）：95-97，108.（in Chinese）

［12］ LI Z L.Protective effects of ascorbate and catalase on human spermatozoa during cryopreservation［J］.Journal of Andrology，2010，31（5）：437-444.

［13］ 李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，2000：279.

［14］ 陳建勛，王曉峰.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)［M］.廣州：華南理工大學(xué)出版社，2002：145.

［15］ 尚曉倩.芍藥花粉超低溫保存研究［D］.北京：北京林業(yè)大學(xué)，2005.

［16］ GILL S S，N TUTEJA.Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（12）：909-930.

［17］ 沈靜.野牛草響應(yīng)低溫脅迫的生理機制和蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［18］ 李晶，閻秀峰，祖元剛.低溫脅迫下紅松幼苗活性氧的產(chǎn)生及保護酶的變化［J］.植物學(xué)報，2000（2）：148-152.LI J，YAN X F，ZU Y G.Generation of activated oxygen and change of cell defense enzyme activity in leaves of korean pine seedling under low temperature［J］.Acta Botanica Sinica，2000（2）：148-152.（in Chinese）

［19］ 吳強，馮漢青，李紅玉，等.干旱脅迫對小麥幼苗抗氰呼吸和活性氧代謝的影響［J］.植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2006（2）：217-224.WU Q，F(xiàn)ENG H Q，LI H Y，et al.Effect of drought stress on cyanide-resistant respiration and metabolism of reactive oxygen in wheat seedling［J］.Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，2006（2）：217-224.（in Chinese）

［20］ 李妮亞，韓淑梅，陳堅，等，不同生境中半紅樹植物抗氧化防御研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，2011，26（5）：29-34，40.LI Y N，HAN S M，CHEN J，et al.Antioxidant defences of mangrove associates in divergent hatitats［J］.Journal of Northwest Forestry University，2011，26（5）：29-34，40.（in Chinese）

［21］ 郭衛(wèi)麗.辣椒對低溫脅迫的響應(yīng)與其低溫抗性相關(guān)基因的克隆和功能分析［D］.楊陵：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

［22］ UCHENDU E E.Vitamins C and E improve regrowth and reduce lipid peroxidation of blackberry shoot tips following cryopreservation［J］.Plant Cell Reports，2010，29（1）：25-35.

［23］ ANTONY，J.，et al.Effects of ascorbic acid on PVS2cryopreservation of Dendrobium Bobby Messina＇s PLBs supported with SEM analysis［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2013，171：315-329.

［24］ 劉忠霞，劉建朝，胡景江.干旱脅迫對蘋果樹苗活性氧代謝及滲透調(diào)節(jié)的影響［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，2013，28（2）：15-19.LIU Z X，LIU J C，HU J J.Effect of drought stress on active oxygen metabolism and contents of osmotic adjustment substances in the leaves of apple seedling［J］.Journal of Northwest Forestry University，2013，28（2）：15-19.（in Chinese）