周金偉，徐綺嬪，姚婧，余樹民，曹隨忠. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 630；. 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，計(jì)劃生育生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 000

CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其在動(dòng)物基因組定點(diǎn)修飾中的應(yīng)用

周金偉1，徐綺嬪1，姚婧2，余樹民1，曹隨忠1
1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2. 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，計(jì)劃生育生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古生菌中抵抗外源病毒或質(zhì)粒入侵的獲得性免疫系統(tǒng)，利用 CRISPR RNAs (crRNAs)引導(dǎo)Cas核酸酶沉默入侵的核酸。通過分子生物學(xué)改造使Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)成為一種高效的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)，并且比鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)和 TALE核酸酶(Transcription activator like effector nucleases, TALENs)結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單，更容易設(shè)計(jì)和應(yīng)用。文章主要介紹了CRISPR/Cas9系統(tǒng)成為高效基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)的發(fā)展歷程、Ⅱ型CRISPR/Cas的工作原理和改造過程以及在動(dòng)物基因組定點(diǎn)修飾的應(yīng)用，剖析了該技術(shù)存在的問題和現(xiàn)有改進(jìn)方案，并與成功案例相結(jié)合展望了 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用前景，以期為動(dòng)物性狀改良和人類疾病動(dòng)物模型的創(chuàng)立提供新思路。

CRISPR/Cas9；基因組編輯技術(shù)；人類疾病動(dòng)物模型；基因組定點(diǎn)修飾

Keywords:CRISPR/Cas9; genome editing technique; animal models of human disease; site-directed genome modification

傳統(tǒng)的動(dòng)物性狀改良是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因插入到受體基因組中，使外源基因整合在染色體基因組上改造基因功能，使其表達(dá)優(yōu)良性狀，并穩(wěn)定地傳給下一代。然而轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在如下缺點(diǎn)：如外源基因隨機(jī)整合與效率低下，表達(dá)可控性差，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)，并且不易獲得表型良好且穩(wěn)定遺傳的后代。因此，動(dòng)物的性狀改良和人類疾病動(dòng)物模型的創(chuàng)制迫切需要發(fā)展動(dòng)物基因組定點(diǎn)修飾的精細(xì)基因編輯技術(shù)。

基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)是實(shí)現(xiàn)動(dòng)物品種改良和構(gòu)建人類疾病動(dòng)物模型的重要研究工具，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，基因編輯技術(shù)不依賴于胚胎干細(xì)胞，能夠應(yīng)用于更多物種，并且具有效率高、定向修飾精確、所需時(shí)間短以及得到的突變可以穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)。近幾年，序列特異性的核酸酶發(fā)展迅速，并且這些核酸酶具有基因組靶向修飾的能力。其中鋅指核酸酶[1](Zinc-finger nucleases, ZFNs)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶[2,3](Transcription activator like effector nucleases, TALENs)都是由序列特異DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與DNA核酸內(nèi)切酶Fok Ⅰ的切割結(jié)構(gòu)域組成。這些核酸酶能夠在特定的基因組位置造成DNA雙鏈斷裂(Double strand break, DSB)，激活細(xì)胞內(nèi)固有的同源重組(Homologous-directed repair, HDR)或非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)基因組的定點(diǎn)修飾，并在一些物種(如小鼠[4]、斑馬魚[5]、牛[6]、豬[7])中成功實(shí)現(xiàn)了基因組定點(diǎn)修飾。最近，在基因組定點(diǎn)修飾方面有了突破性的進(jìn)展，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一種新的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)——Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (CRISPR/Cas9)系統(tǒng)[8]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是利用RNA引導(dǎo)核酸酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行定點(diǎn)修飾，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于小鼠[9]、斑馬魚[10～12]、豬[13,14]、羊[15]等多個(gè)物種，暗示CRISPR/ Cas9基因組編輯技術(shù)能夠擺脫動(dòng)物無(wú)干細(xì)胞系的限制，并且可在任何動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)定向、精準(zhǔn)的基因修飾。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

CRISPR系統(tǒng)是原核生物中一種抵抗外源基因侵入的獲得性免疫系統(tǒng)[16]，在細(xì)菌和古生菌中CRISPR系統(tǒng)整合侵入宿主的噬菌體或者質(zhì)粒DNA的片段到 CRISPR位點(diǎn)，然后通過相應(yīng)的 CRISPR RNAs (crRNAs)引導(dǎo)Cas核酸內(nèi)切酶損壞外源DNA序列，抵抗病毒或者噬菌體的入侵[17]。

1.1 CRISPR/Cas發(fā)展歷程

1987年，日本學(xué)者首次在大腸桿菌(E. coli)基因組中發(fā)現(xiàn)一連串短的空間間隔重復(fù)序列[18]，2002年科學(xué)家才將其命名為成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)[19]，現(xiàn)有測(cè)序結(jié)果顯示40%的細(xì)菌基因組中含有CRISPR位點(diǎn)。2005年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn) CRISPR中的許多間隔序列來源于質(zhì)粒和病毒，CRISPR的基因座能夠被轉(zhuǎn)錄，并且Cas基因編碼的蛋白具有核酸酶和解旋酶結(jié)構(gòu)域，因此推測(cè)CRISPR/ Cas是利用無(wú)義的 RNAs標(biāo)記外源核酸序列的防御系統(tǒng)[20]。2008年，CRISPR/Cas被證明具有免疫能力，在E. coli中成熟的crRNAs引導(dǎo)Cas蛋白形成復(fù)合體，抑制病毒的增殖[21]。2012年，Jinek等[8]首次利用Ⅱ型的CRISPR/Cas系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了目的DNA特定位點(diǎn)雙鏈斷裂，為CRISPR/Cas系統(tǒng)用于基因組定點(diǎn)編輯奠定了基礎(chǔ)。

1.2 CRISPR/Cas的結(jié)構(gòu)

CRISPR是一種特殊的DNA重復(fù)序列，由高度保守的重復(fù)序列(Repeats)與間隔序列(Spacers)交叉排列組成(圖1)，在CRISPR前段有一些保守的Cas蛋白基因，這些Cas基因在CRISPR的防御體系中起著關(guān)鍵作用，并在Cas基因附近有一段幫助crRNAs成熟的轉(zhuǎn)錄活化RNA(Trans-activating crRNA, tracrRNA)。

CRISPR基因座之間都有一個(gè)重復(fù)序列隔開，轉(zhuǎn)錄這些基因座形成前體crRNA，然后通過處理加工形成成熟的crRNA，crRNA中的間隔序列能夠引導(dǎo)效應(yīng)核酸酶復(fù)合體切割與間隔序列互補(bǔ)配對(duì)的雙鏈DNA。細(xì)菌固有的RNA引導(dǎo)免疫系統(tǒng)在執(zhí)行免疫過程中包括3個(gè)不同的步驟：(1)獲得外源DNA；(2)合成成熟crRNA，并形成RNAs-Cas核酸酶蛋白復(fù)合體；(3)通過crRNA識(shí)別外源DNA并利用Cas核酸酶損壞外源DNA[22]。

圖1 CRISPR結(jié)構(gòu)示意圖(參考文獻(xiàn)[23]并修改)

1.3 Ⅱ型 CRISPR/Cas系統(tǒng)的工作原理和 CRISPR/ Cas9基因組編輯技術(shù)的形成

在CRISPR/Cas系統(tǒng)的3種類型(Type Ⅰ、TypeⅡ和Type Ⅲ)中，Type Ⅱ系統(tǒng)具有簡(jiǎn)單、高效以及功能多樣化等優(yōu)點(diǎn)，是用于基因組修飾技術(shù)最合適的選擇。Ⅱ型系統(tǒng)通過crRNA的引導(dǎo)利用單個(gè)Cas9核酸酶充分切割目的DNA的靶位點(diǎn)，并且能夠?qū)蚪M的任何位置進(jìn)行切割。

Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)由間隔重復(fù)CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄出來的pre-crRNA、多功能的Cas9核酸酶和tracrRNA組成，其中tracrRNA促進(jìn)pre-crRNA的成熟，以及形成具有切割活性的crRNA-tracrRNA-Cas9三元復(fù)合體。Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)外源基因的干擾需要多個(gè)步驟：首先，tracrRNA與pre-crRNA的重復(fù)序列結(jié)合；第二，內(nèi)源RNase Ⅲ切割pre-crRNA/ tracrRNAs復(fù)合體，切除5′末端的間隔序列，形成成熟的crRNA，并與tracrRNA形成被稱為向?qū)NA (Single guide RNA, sgRNA)的嵌合RNA分子；第三，每一個(gè)成熟的sgRNA能夠引導(dǎo)Cas9蛋白定位到雙鏈 DNA的靶位點(diǎn)上并在原型間隔毗鄰序列(Protospacer adjacent motif, PAM)的上游3～8 bp位置對(duì)結(jié)合的序列進(jìn)行切割(圖2A)。Cas9的特異性靶點(diǎn)依賴于原型間隔序列3′端PAM序列，不同的Cas9突變體在基因組中擁有不同的PAM序列，來源于釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的 Cas9識(shí)別一個(gè) 5′-NGG-3′的PAM，而來源于嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的 Cas9分別識(shí)別 5′-NNAGAAW-3′的 PAM 和5′-NNNNGATT-3′的PAM[24]。Cas9擁有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，分別是蛋白中間的HNH結(jié)構(gòu)域和蛋白氨基酸末端附近的RuvC-like結(jié)構(gòu)域，其中HNH切割與crRNA互補(bǔ)的鏈，切割位點(diǎn)位于PAM序列上游3 bp，RuvC-like切割非互補(bǔ)鏈，切割位點(diǎn)位于PAM序列上游3～8 bp，從而造成雙鏈的斷裂[8]。CRISPR/ Cas9產(chǎn)生的 DSB能夠激活細(xì)胞和生物體自身修復(fù)機(jī)制，產(chǎn)生兩種不同的修復(fù)途徑NHEJ和HDR修復(fù)(圖 2B)。NHEJ能夠高效地引入不同長(zhǎng)度的插入或者缺失突變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄閱讀框編碼序列，轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的損壞；而HDR的修復(fù)通常會(huì)引入特定位點(diǎn)的突變或者在外源供體 DNA模板存在時(shí)對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行可預(yù)測(cè)的插入[25]。

2012年Jinek等[8]在對(duì)Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因沉默機(jī)制進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，crRNA的原型間隔序列和基因組中原型間隔毗鄰序列決定了 Cas9在基因組中的靶位點(diǎn)，并且只有當(dāng)crRNA和tracrRNA同時(shí)存在形成一種雙鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí) Cas9才能對(duì)質(zhì)粒DNA或者短的雙鏈DNA進(jìn)行切割，因此Jinek等將crRNA的3’末端與tracrRNA的5’末端相連，使crRNA: tracrRNA成為單一轉(zhuǎn)錄的融合RNA，此融合RNA具有crRNA與tracrRNA互補(bǔ)配對(duì)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)從而模仿野生型crRNA: tracrRNA的成對(duì)RNA結(jié)構(gòu)引導(dǎo)Cas9對(duì)DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行切割。在融合RNA的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)tracrRNA 3’末端的長(zhǎng)度將影響Cas9對(duì)DNA靶位點(diǎn)的識(shí)別效率，tracrRNA 3’末端的長(zhǎng)度比crRNA:tracrRNA配對(duì)區(qū)域長(zhǎng)5～12個(gè)堿基時(shí)Cas9對(duì)DNA靶位點(diǎn)的識(shí)別效率最高。通過改變crRNA中的原型間隔序列成功實(shí)現(xiàn)了Cas9在GFP基因中多個(gè)位點(diǎn)的打靶，開啟了CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯的序幕。

1.4 CRISPR/Cas9打靶區(qū)域和sgRNA打靶位點(diǎn)的選擇

對(duì)于sgRNA來說，選擇什么樣的啟動(dòng)子來表達(dá)這一段RNAs可能會(huì)限制靶位點(diǎn)的選擇。RNA聚合酶Ⅲ依賴的U6或者T7啟動(dòng)子在對(duì)RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)分別需要在RNA的5′端多一個(gè)G或者GG。因此這些 sgRNA的表達(dá)就會(huì)形成 GN16-19NGG或者GGN15-18NGG的gRNA，導(dǎo)致在隨機(jī)的基因組DNA中每32 bp或者128 bp才會(huì)出現(xiàn)一個(gè)靶位點(diǎn)。為了檢測(cè)Cas9造成靶位點(diǎn)的雙鏈斷裂，需要在NGG的5′上游3 bp處設(shè)計(jì)一個(gè)用于限制性片段長(zhǎng)度分析的酶切位點(diǎn)。一種策略就是減少靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)的限制條件，比如放棄RNAs 5′端的第一個(gè)或者前兩個(gè)堿基(此種方式將會(huì)使sgRNA在這些位置與基因組出現(xiàn)錯(cuò)配)。另外一種策略就是先設(shè)計(jì)出sgRNAs 5′端無(wú)G或者GG序列，然后在進(jìn)行引物合成時(shí)sgRNA 5′端加入G或者GG，因此轉(zhuǎn)錄出的gRNA會(huì)比設(shè)計(jì)的長(zhǎng)1～2 bp。以上兩種方法都能合成有活性的sgRNA，但是在基因修飾中會(huì)使Cas9核酸酶有不同的效率[26]。

圖2 Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)的成熟與工作原理(參考文獻(xiàn)[23]并修改)

CRISPR/Cas9對(duì)基因組 DNA的特異切割需要兩個(gè)主要的因素：一個(gè)是 20 bp的引導(dǎo)序列，另一個(gè)是存在于sgRNA結(jié)合位點(diǎn)3′末端的PAM序列。sgRNA中20 bp的序列能夠和基因組的DNA靶位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)，也能夠和基因組中成千上萬(wàn)的其他序列進(jìn)行不完美的配對(duì)(脫靶)。研究表明，Cas9的活性和切割特異性由靠近PAM序列的8～12 bp決定，并且PAM末端的部分錯(cuò)配不會(huì)影響Cas9的活性，因此必須重視CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)[27]。

針對(duì)sgRNA的設(shè)計(jì)策略，在設(shè)計(jì)基因組靶位點(diǎn)的引導(dǎo)序列時(shí)，研究者需要對(duì)引導(dǎo)序列的特異性和潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于靶位點(diǎn)的選擇，研究者可以使用一些在線設(shè)計(jì)工具，如：ZiFiT Targeter software (http://zifit.partners.org)[28]和麻省理工學(xué)院張鋒實(shí)驗(yàn)室建立的CRISPR設(shè)計(jì)工具(http://crispr.mit.edu/)[29]。其中張鋒實(shí)驗(yàn)室的在線設(shè)計(jì)工具能夠預(yù)測(cè)在基因組中的潛在脫靶位點(diǎn)，并根據(jù)脫靶位點(diǎn)錯(cuò)配堿基數(shù)位置和分布進(jìn)行脫靶評(píng)分(分?jǐn)?shù)反映脫靶的可能性)，并且能夠給每一個(gè)設(shè)計(jì)的 gRNA進(jìn)行評(píng)分(分?jǐn)?shù)高的表示脫靶效率低)。通過軟件預(yù)測(cè)，選擇脫靶位點(diǎn)少并且靶序列在外顯子上的靶位點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)中還應(yīng)該對(duì)5個(gè)潛在脫靶序列進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估靶序列的脫靶效應(yīng)。

2 CRISPR/Cas9在基因組編輯中的應(yīng)用

2013年，Cong等[30]利用Jinek改造的CRISPR /Cas9系統(tǒng)最早在人類細(xì)胞和小鼠細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)了基因組的定點(diǎn)編輯，開啟了基因組編輯的新時(shí)代。之所以稱其開啟了基因組編輯的新時(shí)代，是因?yàn)镃RISPR/Cas9系統(tǒng)一方面同樣具有ZFNs和TALENs的基因編輯可遺傳以及修飾多樣性等優(yōu)點(diǎn)，另一方面還具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：(1) CRISPR/Cas9的靶點(diǎn)在基因組中擁有非常高的分布頻率，在基因組中幾乎每8 bp就有一個(gè)靶點(diǎn)；(2) 可以同時(shí)對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行基因操作；(3) 實(shí)驗(yàn)周期短，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，節(jié)約大量的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。

到目前為止，CRISPR/Cas9被廣泛地應(yīng)用于多個(gè)物種和多種細(xì)胞類型，并且獲得了高效的基因修飾結(jié)果(表1)。

表1 通過CRISPR/Cas9基因定點(diǎn)編輯的細(xì)胞類型和生物體

Cong等[30]構(gòu)建了兩種類型的Ⅱ型 CRISPR/ Cas9系統(tǒng)，證明縮短的sgRNA(Truncated gRNA, trusgRNA)能夠提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性；PAM序列3′ 端堿基錯(cuò)配不會(huì)影響剪切效率；并且把多個(gè)引導(dǎo)序列集合在一個(gè)gRNA上能夠引導(dǎo)Cas9實(shí)現(xiàn)基因組多位點(diǎn)的同時(shí)編輯，顯示了CRISPR/Cas9系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。Thomas等[12]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在斑馬魚胚胎中通過顯微注射的方法成功實(shí)現(xiàn)了 Gal4定點(diǎn)編輯，并且在注射sgRNA和Cas9 mRNA的同時(shí)加入了與目的Gal4突變位點(diǎn)同源的含有eGFP的供體DNA序列，成功實(shí)現(xiàn)了 eGFP的插入，效率達(dá)到了 22%。Yin等[42]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在斑馬魚眼中實(shí)現(xiàn)了ascl1a基因的條件性敲除，對(duì)斑馬魚光感受器的再生機(jī)制研究提供了新的方向。Wang等[9]在小鼠胚胎中同時(shí)注射體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA和多基因sgRNAs實(shí)現(xiàn)了(Tet1、Tet2、Tet3、Sry和Uty)多基因同時(shí)定點(diǎn)突變。Wu等[43]利用CRISPR/Cas9對(duì)一只Crygc顯性突變的小鼠進(jìn)行基因治療使其獲得了健康的后代，共同注射Cas9 mRNA和靶向Crygc基因的sgRNA到Crygc顯性突變合子中，利用外源的寡聚核苷酸或者內(nèi)源的WT等位基因作為供體通過同源重組修復(fù)方式對(duì) Crygc基因進(jìn)行修復(fù)，獲得了能夠生育并且能將修正后的 Crygc基因傳給下一代的健康小鼠，此項(xiàng)成果為CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于遺傳疾病的基因治療提供了依據(jù)。Li等[44]利用多個(gè)sgRNAs共同作用于人和老鼠中，成功實(shí)現(xiàn)了DNA調(diào)控元件和基因簇的倒位和串聯(lián)，并且能夠高效正確的倒位和串聯(lián)幾十bp甚至幾百kb的DNA片段；在人類細(xì)胞中4 個(gè)sgRNAs的共同作用實(shí)現(xiàn)了Pcdh基因簇的成功倒位和串聯(lián)；在小鼠中利用成對(duì)的 sgRNAs實(shí)現(xiàn)了基因組任意片段大小的刪除和染色體倒位，突變效率與兩個(gè)sgRNAs在染色體中的間隔長(zhǎng)度有關(guān)。

雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)被改造為基因編輯工具僅兩年多時(shí)間，但是CRISPR/Cas9技術(shù)用于動(dòng)物品種改良和人類疾病動(dòng)物模型的創(chuàng)制已經(jīng)有了一些可喜的成果。例如，南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所黃行許教授課題組首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了內(nèi)源Ppar-γ、Rag1基因突變的靈長(zhǎng)類動(dòng)物食蟹猴(Macaca fascicularis)[41]；Zhou等[14]利用 CRISPR/Cas9技術(shù)與體細(xì)胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)的有機(jī)結(jié)合，獲得了TYR、PARK2、PINK1突變豬；Ni等[15]獲得了MSTN、NUP、PrP與BLG基因突變的山羊；Sato等[45]獲得了 α-1,3-半乳糖苷酶(α-1, 3-galactosyltransferase，α-GalT)雙等位基因缺失的豬胎兒成纖維細(xì)胞，為人類異種器官移植研究提供了幫助；Chen等[46]利用 CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)獼猴(Macaca mulatta)的肌萎縮蛋白基因(Dystrophin gene)進(jìn)行了嵌合打靶突變，其突變效率達(dá)到了87%，人類臨床上杜氏肌萎縮癥疾病(Duchenne muscular dystrophy, DMD)患者都存在肌萎縮蛋白基因突變，該研究發(fā)現(xiàn)肌萎縮蛋白基因缺失的獼猴出現(xiàn)肌營(yíng)養(yǎng)蛋白明顯減少以及肌肉萎縮的表型與人類早期 DMD臨床表型相似。這些成果為利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行基因修飾、品種培育和人類疾病動(dòng)物模型創(chuàng)制提供了重要的參考依據(jù)。

Hai等[13]和 Zhou等[14]以豬為研究對(duì)象，應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立了基因修飾的動(dòng)物疾病模型，將對(duì)人類疾病和家畜疫病的發(fā)病機(jī)理和治療方法的研究起到推動(dòng)作用。豬是我國(guó)最重要的家畜品種之一，同時(shí)也是生物醫(yī)學(xué)研究中重要的模式動(dòng)物。小型豬在心血管、胃腸道等多項(xiàng)生理特征上比嚙齒類更接近人類，其器官大小與功能也與人十分接近，而且其產(chǎn)仔量高易繁殖?；诖耍瑢?duì)豬進(jìn)行精細(xì)的基因組修飾，從而建立用于研究豬的疾病或人類疾病的模型，對(duì)于畜牧生產(chǎn)和生物醫(yī)學(xué)研究都具有重要價(jià)值。賴良學(xué)研究組利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得TYR敲除的豬胎兒成纖維細(xì)胞(Pig fetal fibroblasts, PFF)，然后通過SCNT 得到成活的TYR敲除豬，TYR敲除導(dǎo)致豬存在典型的白化表型[14]；周琪領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)直接向廣西巴馬小型豬的受精卵中注射定點(diǎn)切割vWF的Cas9 mRNA和sgRNA，高效地獲得了雙等位基因突變的廣西巴馬小型豬，人類臨床上Ⅰ型和Ⅲ型血管性血友病患者都存在vWF的突變，該研究還發(fā)現(xiàn)這些vWF敲除豬具有嚴(yán)重的凝血功能障礙，與血管性血友病患者的臨床表型相似[13]。最近本研究團(tuán)隊(duì)還應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)與顯微注射技術(shù)獲得小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Microphthalmia-associated transcription factor, MITF)雙等位基因缺失的廣西巴馬小型豬，其體內(nèi)突變效率達(dá)到了100%。

2015年CIRSPR/Cas9在致病基因篩選方面有了新的突破。Chen等[47]將含有Cas9-GFP表達(dá)質(zhì)粒的原癌細(xì)胞通過小鼠全基因組 CRISPR敲除引導(dǎo)文庫(kù)處理，并將處理后的細(xì)胞皮下注射到小鼠體內(nèi)，5周后發(fā)現(xiàn)這些原癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到肺部，通過分離和測(cè)序分析肺部癌癥細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) Nf2、Pten、Trim72、Cdkn2a、Fga、Cryba4、miR-152和miR-345等基因與腫瘤進(jìn)化和轉(zhuǎn)移有關(guān)。這項(xiàng)研究使得利用CIRSPR/Cas9在體內(nèi)鑒別癌癥和其他復(fù)雜疾病中的重要基因邁出了關(guān)鍵一步。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)可分為兩個(gè)方面：(1)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)自身的完善；(2)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)新的生物學(xué)功能開發(fā)。

3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的自我完善

CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶位點(diǎn)只有20 bp左右，并且在基因組中每8 bp就存在一個(gè)靶位點(diǎn)，因此能夠靈活地實(shí)行基因定點(diǎn)編輯，可以將多個(gè)引導(dǎo)序列串聯(lián)在一起引導(dǎo) Cas9實(shí)現(xiàn)基因組多位點(diǎn)或多基因的同時(shí)編輯。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)不同物種和不同基因進(jìn)行編輯時(shí)其效率有較大的差異，因此CRISPR/Cas9系統(tǒng)的穩(wěn)定性還有待于更全面地探索和研究，進(jìn)而提高該系統(tǒng)的高效性和普遍適用性。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性是由 PAM前 20 bp的RNA與DNA互補(bǔ)配對(duì)決定的，在基因組中存在很多與這 20 bp序列不完全匹配的位點(diǎn)，因此理論上CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶的概率會(huì)較高。Cong等[30]在人類細(xì)胞中檢測(cè)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性，發(fā)現(xiàn)RNA-DNA互補(bǔ)配對(duì)時(shí)存在5個(gè)堿基錯(cuò)配，該系統(tǒng)仍會(huì)對(duì)此位點(diǎn)進(jìn)行非特異性切割。目前，已有科研人員對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)進(jìn)行了相應(yīng)研究。Fu等[48]在細(xì)胞中使用17～18 bp縮短的sgRNA能夠降低脫靶效率，并且直接轉(zhuǎn)染合成的sgRNA比轉(zhuǎn)染質(zhì)粒有更高的特異性；Jienk等[8]對(duì)sgRNA研究表明，延伸sgRNA的3′端能增加CRISPR/Cas9系統(tǒng)在目的基因位點(diǎn)的突變效率，降低脫靶效率。

3.2 CRISPR/Cas9新的生物學(xué)功能開發(fā)

目前CRISPR/Cas9的應(yīng)用主要集中在基因組修飾，而CRISPR/Cas9還能開發(fā)出更多的生物學(xué)功能。由于RNAs粘附在sgRNA末端不會(huì)影響sgRNA綁定 Cas9，因此將功能蛋白與無(wú)核酸酶活性的Cas9(dCas9)融合，從而實(shí)現(xiàn)功能蛋白與 DNA序列的結(jié)合。因此，Cas9攜帶一些融合蛋白或融合RNA到雙鏈DNA序列，可以調(diào)控基因的表達(dá)和染色體結(jié)構(gòu)。例如：利用調(diào)控復(fù)合體與染色體的精細(xì)交互作用調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，可以利用sgRNA將dCas9作為假的轉(zhuǎn)錄因子引入到基因的關(guān)鍵位點(diǎn)，可能會(huì)影響轉(zhuǎn)錄因子與染色體的結(jié)合；此外，利用 dCas9融合蛋白和sgRNA將未知功能的單個(gè)因子綁定到基因組的任何位置，將會(huì)為基因功能和細(xì)胞信號(hào)通路的研究提供新的策略[49]。

首先，CRISPR/Cas9能夠?qū)崿F(xiàn)根據(jù)科研人員的期望直接上調(diào)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄水平。在之前研究中科研人員利用TALE效應(yīng)將轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子VP64結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)域能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)錄[50]。科研人員利用CRISPR/Cas9在基因組中的定位功能，構(gòu)建了dCas9-VP64融合蛋白，以及sgRNA綁定的MS2-VP64蛋白，這兩種重組蛋白需要多個(gè)Cas9-sgRNA活性因子的協(xié)同作用才能夠明顯的提高目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。Polstein 等[51]將光誘導(dǎo)異二聚體蛋白CRY2融合到VP64的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，CIBN融合到dCas9的C端和N端，并將這兩種重構(gòu)蛋白和靶向人類IL1RN啟動(dòng)子的4個(gè)sgRNA同時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在藍(lán)光的刺激下細(xì)胞IL1RN的表達(dá)量提高了10～100倍。Konermann等[52]將轉(zhuǎn)錄因子與dCas9融合或sgRNA綁定，將相應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活因子進(jìn)行組合篩選出sgRNA-dCas9-VP64與MS2-p65-HSF1協(xié)同作用的組合方式，此種組合將 TINCR、HOTTIP、PCAT、LINC00925、LINC00514和LINC00028基因的表達(dá)量提升10～100倍。利用此種方法，建立了70 290個(gè)sgRNAs的文庫(kù)，將CRISPR元件引入大量體外培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞，不同細(xì)胞對(duì)應(yīng)靶標(biāo)不同基因的引導(dǎo)RNA，然后用PLX-4720處理這些細(xì)胞，最終確定了 13個(gè)特殊的基因可以使癌細(xì)胞對(duì)PLX-4720產(chǎn)生抗藥性。一般而言，只有當(dāng)多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行復(fù)雜調(diào)控時(shí)，才能夠?qū)е录膊』驀?yán)重生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)生。因此，為了詳盡地了解疾病或生物學(xué)效應(yīng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，需要利用基因分庫(kù)和基因劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以便確定是哪些基因共同決定了某些性狀。在未來的研究中，能夠?qū)Ω鞣N不同的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多重靶向和多重調(diào)控的CRISPR/Cas9系統(tǒng)將會(huì)成為了解基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的萬(wàn)能工具。

其次，利用ZFN效應(yīng)蛋白和TALE效應(yīng)蛋白招募轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域能夠有效地抑制內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄。目前，對(duì) CRSPRi的研究也有了新的成果。Ji 等[53]構(gòu)建了dCas9與相應(yīng)sgRNA共表達(dá)的質(zhì)粒，使大腸桿菌中mRFP的表達(dá)量下降了330倍；Gilbert 等[54]將 dCas9與轉(zhuǎn)錄抑制因子 KRAB(Krüppel associated box)結(jié)合組成dCas9-KRAB融合蛋白，并用慢病毒轉(zhuǎn)染使其在HeLa細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體CD71和趨化因子受體CXCR4的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)設(shè)計(jì)了相應(yīng)的 sgRNAs，將其轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達(dá)dCas9-KRAB融合蛋白的 HeLa細(xì)胞中，CD71和CXCR4表達(dá)量下降 60%～80%，并且干擾效率受到sgRNA與靶位點(diǎn)結(jié)合效率的影響；Choudhary等[55]構(gòu)建了一種優(yōu)化的 dCas9，其在結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)中的表達(dá)量是普通dCas9的80倍，在sgRNAs的靶向引導(dǎo)下使分支桿菌中engA、ftsZ、clpP2、groEL1、groES、clpC1和yidC的表達(dá)量下降80%，證明CRISPRi具有多基因同時(shí)沉默的能力。此外，CRISPR/Cas9在轉(zhuǎn)錄抑制方面的作用還可以用于真核生物抗病毒研究，通過阻止外源入侵病毒基因的轉(zhuǎn)錄，將與某些病毒基因特定的sgRNA和Cas9阻遏物的編碼序列整合在生物體中，能夠獲得免疫DNA病毒的生物體。此種構(gòu)想可用于培育出免疫任何 DNA病毒的優(yōu)勢(shì)農(nóng)作物或者家畜。

再次，Maeder等[56]將TALE與Tet1的羥化酶催化域融合，使用此種TALE-Tet1融合蛋白使HEK293 和HeLa細(xì)胞中RHOXF2(一種只在雄性生殖細(xì)胞中表達(dá)的印跡基因)基因的去甲基化程度提高了15%，并且在HEK293和HeLa細(xì)胞中檢測(cè)到了高水平的RHOXF2 基因mRNA。雖然文獻(xiàn)中還未見CRISPR/Cas9的染色體修飾功能，但是其在表觀遺傳修飾方面仍然具有廣闊的發(fā)展空間。原則上，Cas9能夠精確地招募染色質(zhì)-重構(gòu)復(fù)合體(Chromatin-remodeling complexes)，包括 Swi-Snf、組蛋白乙酰化酶(Histone acetylases)、組蛋白去乙?；?Histone deacetylases)、甲基化酶(Methylases)和去甲基化酶(Demethylases)、激酶和磷酸化酶，以及 DNA甲基化酶(Methylases)和去甲基化酶(Demethylases)。如果這些構(gòu)想能夠成功實(shí)現(xiàn)，科研人員將有能力研究生物體的表觀遺傳調(diào)控，并且能延長(zhǎng)任何基因的表達(dá)期限[49]。

此外，CRISPR/Cas9還可以用于調(diào)控基因組的結(jié)構(gòu)，通過構(gòu)建Cas9重組酶，引導(dǎo)更加精確的基因修飾，將用于人類基因治療或者靶向藥物的研制。

4 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是一種強(qiáng)大的基因工程工具，將會(huì)在基因功能解析、人類基因治療、靶向藥物研制、人類疾病動(dòng)物模型的創(chuàng)制以及家畜育種中大放異彩，有望加速豬、牛、羊等重要家畜性狀改良與分子定向育種。更令人振奮的是，CRISPR/Cas9具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、節(jié)約成本、實(shí)驗(yàn)操作性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，必將成為普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常用技術(shù)。因此，有理由相信該技術(shù)將對(duì)生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展起到深遠(yuǎn)影響。雖然關(guān)于

CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的部分問題有待于進(jìn)一步解決與發(fā)展，但是隨著科研人員對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究的不斷深入使其穩(wěn)定性與廣泛應(yīng)用性的進(jìn)一步完善，CRISPR/Cas9系統(tǒng)將更好的幫助科研人員研究基因的功能，探索基因組的奧秘。

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(責(zé)任編委: 高彩霞)

CRISPR/Cas9 genome editing technique and its application in site-directed genome modification of animals

Jinwei Zhou1, Qipin Xu1, Jing Yao2, Shumin Yu1, Suizhong Cao1
1. College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2. State Key Laboratory of Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

CRISPR/Cas system, which uses CRISPR RNAs (crRNAs) to guide Cas nuclease to silence invading nucleic acids, is self-defense system against exogenous virus or plasmid in bacteria and archaea. Through molecular modification, the typeⅡCRISPR/Cas system has become a highly efficient site-directed genome editing technique, which is simpler than zinc-finger nucleases (ZFNs) and transcription activator like effector nucleases (TALENs) and easier to be designed and applied. In this review, we summarize the evolutionary history of CRISPR/Cas9 system, the working principle and modification process of type Ⅱ CRISPR/Cas and its application in animal genome modification. We also analyze the existing problems and improvement program of the CRISPR/Cas9 system as well as its application prospect combined with successful cases, which may provide innovative perspectives on improving animal traits and establishing animal models of human diseases.

2015-02-03;

2015-04-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31272400，31172379)和四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科建設(shè)雙支計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：3570806)資助

周金偉，碩士，專業(yè)方向：大動(dòng)物遺傳與修飾。E-mail: zhoujinwei08@126.com

曹隨忠，教授，研究方向：獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)。E-mail: suizhongcao@126.com

10.16288/j.yczz.15-066

時(shí)間:2015-6-17 15:14:43

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150617.1514.001.html