程立子 吳日然 于文娟 徐建亞 廖月嬋 杜 靜

南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山市博愛醫(yī)院生殖中心，廣東中山 528403

體外培養(yǎng)1 d對(duì)玻璃化解凍卵裂期胚胎移植效果的影響

程立子 吳日然 于文娟 徐建亞 廖月嬋 杜 靜

南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山市博愛醫(yī)院生殖中心，廣東中山 528403

目的探討體外培養(yǎng)1 d對(duì)玻璃化解凍卵裂期胚胎移植效果的影響。方法選擇本中心2012年1～7月進(jìn)行玻璃化冷凍并復(fù)蘇的277周期卵裂期胚胎作為研究對(duì)象，根據(jù)解凍后是否多培養(yǎng)1 d分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組在解凍當(dāng)天移植，共123周期。實(shí)驗(yàn)組解凍后多培養(yǎng)1 d，共154周期。實(shí)驗(yàn)組又分為培養(yǎng)后含桑葚胚組(A 組)及無桑葚胚組(B組)。觀察延長體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)妊娠結(jié)局的影響以及培養(yǎng)后胚胎發(fā)育情況與妊娠結(jié)局的關(guān)系。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組的妊娠率和著床率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。A組的妊娠率與著床率顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論體外培養(yǎng)1 d不影響玻璃化解凍后卵裂期胚胎的移植效果，延長培養(yǎng)時(shí)間有利于選擇發(fā)育良好的胚胎并顯著提高臨床妊娠率和著床率。

體外培養(yǎng);玻璃化解凍;卵裂期胚胎;桑葚胚

胚胎冷凍保存技術(shù)在輔助生殖技術(shù)中占有重要地位。研究顯示，玻璃化冷凍復(fù)蘇后的胚胎代謝和細(xì)胞分裂的速度比程序冷凍解凍后的胚胎更快［1］。這項(xiàng)技術(shù)大大提高了體外授精-胚胎移植 (in vitro fertil ization and embryo transfer，IVF-ET)的累積妊娠率，有利于預(yù)防嚴(yán)重的卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)，在為患者減少經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的同時(shí)也增加了患者受孕的概率。本研究選取玻璃化解凍后在體外培養(yǎng)1 d的胚胎作為研究對(duì)象，觀察其發(fā)育情況，旨在探討延長體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本中心2012年1～7月進(jìn)行玻璃化冷凍并復(fù)蘇的卵裂期胚胎作為研究對(duì)象，共277周期，冷凍胚胎均為第3天卵裂期胚胎。根據(jù)復(fù)蘇后移植時(shí)間的不同分為對(duì)照組(當(dāng)天移植組)和實(shí)驗(yàn)組(體外培養(yǎng)1 d后移植組)。對(duì)照組共123周期，平均年齡為(31.03± 4.10)歲。實(shí)驗(yàn)組共154周期，平均年齡為(31.26± 3.81)歲。所有患者均按本中心常規(guī)方法進(jìn)行促排卵、取卵、體外受精及培養(yǎng)。所有胚胎均于第3天進(jìn)行玻璃化冷凍。實(shí)驗(yàn)組根據(jù)胚胎發(fā)育后是否含有桑椹胚分為A組(含桑葚胚)和B組(不含桑葚胚)，桑葚胚指含有12～16個(gè)卵裂球的胚胎。

1.2 方法

1.2.1 冷凍胚胎選擇 根據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)于第3天對(duì)胚胎進(jìn)行分級(jí)，正常受精且第3天卵裂球數(shù)≥4個(gè)并且碎片≤20%的Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎為可利用胚胎。經(jīng)患者同意，將移植后剩余的可利用胚胎冷凍或者將所有可利用胚胎冷凍。

1.2.2 胚胎冷凍解凍方法 玻璃化冷凍液(Vitrolife?，RapidVitTMCleave，3×10 ml，REF 10117)及解凍液(Vitrolife?，RapidWarmTMCleave，4×10ml，REF 10118)由廣州尊博醫(yī)療器械有限公司提供。①玻璃化冷凍方法:按照Vitrolife?公司RapidVitTMCleave試劑說明書要求，將試劑從冰箱內(nèi)取出后預(yù)熱至37℃，將1～3個(gè)胚胎放入Vitri 1TMCleave液中平衡5～10 min，然后放入Vitri2TMCleave液中2min，可看到胚胎先皺縮后恢復(fù)原狀，然后將胚胎轉(zhuǎn)移入Vitri3TMCleave液中約30 s，吹打2～3次后將胚胎放到冷凍載體(自制)上，立即投入液氮中。整個(gè)過程均在37℃條件下進(jìn)行。②玻璃化解凍方法:按照Vitrolife?公司RapidWarmTMCleave試劑說明書要求，將試劑從冰箱內(nèi)取出后預(yù)熱至37℃，將裝有胚胎的載體從液氮中取出，迅速放入復(fù)蘇液Warm 1TMCleave中，10～30 s后將胚胎依次轉(zhuǎn)移至Warm 2TMCleave 1 min、Warm 3TMCleave 2 min，Warm 4TMCleave 5min，最后轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液Vitrolife?G-2 plus中，置于37℃、6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 胚胎復(fù)蘇成功標(biāo)準(zhǔn) 解凍后存活卵裂球數(shù)≥50%。

1.2.4 患者的準(zhǔn)備 ①自然周期:月經(jīng)規(guī)律、排卵正?；颊卟捎米匀恢芷?，利用陰道超聲技術(shù)監(jiān)測卵泡及內(nèi)膜發(fā)育情況，當(dāng)優(yōu)勢卵泡直徑≥16 mm、子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)檢測是否出現(xiàn)黃體生成素(LH)峰，LH峰后36 h左右排卵，排卵日開始肌注黃體酮20～60 mg/d，排卵后第3天解凍胚胎。②激素替代周期:月經(jīng)不規(guī)則、排卵障礙、子宮內(nèi)膜生長不良等患者采用激素替代周期。于月經(jīng)第3天起用遞增法口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，先靈公司)，B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度，當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8mm時(shí)開始每日肌注黃體酮，3 d后解凍胚胎。胚胎移植在B超引導(dǎo)下進(jìn)行。

1.3 妊娠診斷

移植2周后測定血HCG水平，陽性者為生化妊娠，35 d后行B超檢查，有孕囊者則診斷為臨床妊娠。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胚胎復(fù)蘇率、平均移植胚胎數(shù)、妊娠率與著床率的比較

實(shí)驗(yàn)組的妊娠率和著床率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胚胎復(fù)蘇率、平均移植胚胎數(shù)、妊娠率與著床率的比較

2.2 A組與B組平均移植胚胎數(shù)、妊娠率與著床率的比較

A組的妊娠率與著床率顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表2)。

表2 A組與B組平均移植胚胎數(shù)、妊娠率與著床率的比較

3 討論

3.1 凍融后獲得高質(zhì)量的胚胎是影響冷凍胚胎移植結(jié)果的重要因素

在輔助生殖技術(shù)中，由于控制性超排卵技術(shù)的應(yīng)用，90%的患者可在一次體外受精周期獲得較多胚胎。本中心70%以上患者的胚胎需要進(jìn)行冷凍保存。玻璃化冷凍方法穩(wěn)定、高效、對(duì)胚胎的發(fā)育潛力影響最小，為預(yù)防OHSS發(fā)生起到了重要作用，甚至有人認(rèn)為解凍周期移植可能會(huì)完全取代新鮮周期移植［2］，但目前凍融過程仍不完美，胚胎經(jīng)過冷凍和復(fù)蘇的過程后，部分卵裂球會(huì)受損傷，發(fā)生裂解凋亡或者壞死，而壞死的卵裂球也會(huì)影響其他卵裂球的發(fā)育［3］。即使是卵裂球全部存活的解凍胚胎也有可能受到肉眼無法分辨的損傷，繼而降低繼續(xù)分裂的能力。研究顯示，胚胎冷凍雖然能保持胚胎的發(fā)育潛力，但冷凍和解凍的過程會(huì)導(dǎo)致胚胎減少30%的發(fā)育能力，進(jìn)而導(dǎo)致囊胚形成率和妊娠率降低［4］。

3.2 延長體外培養(yǎng)時(shí)間、觀察解凍后胚胎的繼續(xù)發(fā)育情況對(duì)評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育潛力的意義

關(guān)于延長體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胚胎發(fā)育的影響，目前觀點(diǎn)尚不統(tǒng)一，本研究結(jié)果與葉英輝等［4-9］的研究結(jié)果一致，提示延長胚胎復(fù)蘇后的體外培養(yǎng)時(shí)間，相比于解凍當(dāng)日移植的胚胎，其妊娠率和種植率均可明顯提高，而Rato等［10］的研究顯示，胚胎解凍后培養(yǎng)2～5 h，其種植率及活產(chǎn)率均高于解凍后培養(yǎng)24 h，相關(guān)研究結(jié)果同樣顯示解凍后次日移植不能提高臨床妊娠率和種植率［11-13］。

延長解凍后體外培養(yǎng)時(shí)間，無疑會(huì)更有利于觀察胚胎的發(fā)育情況。本研究結(jié)果顯示，解凍后大多胚胎都能恢復(fù)應(yīng)有的發(fā)育能力，但是其中部分胚胎發(fā)育速度較慢(如只增多1～3個(gè)卵裂球)，這些胚胎在妊娠率、著床率方面顯著低于正常發(fā)育的移植胚胎。羅金等［14］的研究顯示，延長解凍后體外培養(yǎng)時(shí)間，可觀察到無法繼續(xù)生長的胚胎，這類胚胎發(fā)育潛能低，因此，可根據(jù)解凍后胚胎生長情況來選擇發(fā)育潛能大的胚胎進(jìn)行移植。此外，其研究顯示，部分已復(fù)蘇的胚胎可能受到了不可見的損傷，僅少數(shù)卵裂球恢復(fù)發(fā)育能力，這些胚胎的整體發(fā)育潛能較低下，這與本研究結(jié)果一致。

3.3 胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜生長是否同步對(duì)著床的影響

本研究結(jié)果顯示，解凍后培養(yǎng)1 d后再行移植的含有發(fā)育至桑葚胚及以上的胚胎，其著床率及妊娠率顯著高于移植不含桑葚胚的胚胎。凍融胚胎移植時(shí)機(jī)的選擇非常重要，胚胎發(fā)育的速度與子宮內(nèi)膜成熟度不一致也可能是導(dǎo)致種植失敗的原因之一。玻璃化冷凍胚胎解凍后發(fā)育速度較快，只有提前1 d準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜，才能更好地讓兩者保持一致，而凍融后選擇發(fā)育潛能好的胚胎進(jìn)行移植，其著床率與妊娠率均有顯著提高［15-17］。

綜上所述，胚胎質(zhì)量是影響解凍周期移植成功的關(guān)鍵因素［18］，延長體外培養(yǎng)時(shí)間不會(huì)增加胚胎自身的發(fā)育潛能，但是可以通過此種方法來觀察胚胎復(fù)蘇后的生長情況，繼而更好地評(píng)估其未來的發(fā)育潛力。發(fā)育潛力高的胚胎與子宮內(nèi)膜成熟度的同步性越高，越有利于胚胎著床。通過多培養(yǎng)1 d選擇出更適宜移植的胚胎，可以將發(fā)育潛力差的胚胎淘汰，保證移植周期中的胚胎質(zhì)量，提高臨床妊娠率和著床率。

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Influence of one-day culture in vitro on embryo transp lantation effect of vitrification-unfreezing at cleavage stage

CHENG Li-zi WU Ri-ran YUWen-juan XU Jian-ya LIAO Yue-chan DU Jing
Reproductive Cente,Boai Hospital of Zhongshan City Affiliated to Southern Medical University,Zhongshan 528403, China

ObjectiveTo explore the influence of one-day culture in vitro on embryo transplantation effect of vitrification-unfreezing at cleavage stage.Methods277 cycles of cleavage stage embryos on revived transplantation of vitrification-unfreezing at cleavage stage from January 2012 to July in our center were selected and divided into the control group(123 cycles)and the experimental group(154 cycles)according towhether one-daymore culture after unfreezing. The control group was transplantated during the same day after unfreezing,the experimental group was transplantated one-daymore culture after unfreezing.The experimental group was again divided intomorula group(group A)and nonmorula group(group B)after cultivation.Influences on extended culture in vitro on pregnancy outcome and relationships between embryonic development after cultivation and pregnancy outcome were observed.ResultsThe pregnancy rate and the rate of embryonic implantation in the experimental group was higher than that in the control group,with significant difference(P＜0.05).The pregnancy rate and the rate of embryonic implantation in group A was higher than that in group B,with significant difference(P＜0.05).ConclusionOne-daymore culture in vitro does not affect on embryo transplantation of vitrification-unfreezing at cleavage stage.Extension of culture period is beneficial to selectwell-developed embryo and also remarkably improves clinical pregnancy rate and rate of embryonic implantation.

Culture in vitro;Vitrification-unfreezing;Cleavage-stage embryo;Morula

R321

A

1674-4721(2015)09(c)-0045-04

2015-03-09 本文編輯:祁海文)

廣東省中山市醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(2013A020016)