徐靜 孫新梅 陶露

光動力學(xué)療法的抑瘤作用和免疫效應(yīng)的實驗研究

徐靜1孫新梅2陶露1

目的探討光動力學(xué)療法（PDT）抑瘤效應(yīng)的免疫機理，以及PDT聯(lián)合腫瘤局部注射卡介苗（BCG）的治療效果。方法建立小鼠Heps肝癌移植瘤模型96只，隨機分為對照組、PDT組、BCG組和聯(lián)合組。觀測各組移植瘤體積的變化。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA），測定各組荷瘤小鼠血清中白細胞介素（interleukin，IL）-1β的變化。結(jié)果（1）各治療組治療后7 d的移植瘤體積較對照組均明顯縮小（P ＜0.01）。聯(lián)合組治療后7 d的腫瘤體積較單純PDT組明顯縮?。≒ ＜0.05）。（2）ELISA結(jié)果顯示，PDT組和聯(lián)合組治療后2 h、24 h以及7 d荷瘤小鼠血清中IL-1β的含量，均高于對照組和BCG組（P ＜0.01）。聯(lián)合組治療后2 h、24 h以及7 d荷瘤小鼠血清中IL-1β的含量，超過單純PDT組（P＜0.05）。結(jié)論結(jié)果顯示PDT對強化荷瘤宿主免疫力有顯著作用。使肝癌移植瘤體積明顯縮小。PDT聯(lián)合局部注射BCG的治療方法的療效優(yōu)于單用PDT和單用BCG。

Heps肝癌細胞株；光動力學(xué)療法；卡介苗；細胞因子；小鼠

光動力學(xué)療法（photodynamic therapy，簡稱PDT）是運用激光激活能于腫瘤組織中富集并且可長時間潴留的藥物（主要是光敏物質(zhì)）而產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)殺傷腫瘤細胞的治療方法。PDT已經(jīng)普及到各類惡性腫瘤的姑息治療等應(yīng)用中，但其作用機制亦仍未完全闡明。已有研究成果表明，特定的免疫效應(yīng)的產(chǎn)生對惡性腫瘤的遏制發(fā)揮了顯著治療效用，而該種免疫效應(yīng)正是由存在于宿主內(nèi)的PDT激活引起的[1-2]。本文主要借助對小鼠肝癌移植瘤在PDT前后不同發(fā)展現(xiàn)象的分析，對小鼠血清中細胞因子數(shù)量的增減現(xiàn)象的觀察，研究PDT在治療腫瘤方面的基本原理。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗所需材料

1.1.1 實驗動物對象 徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供的ICR小鼠，數(shù)量共計96只。小鼠均為8～10周齡的雄性，體重為20 g，誤差±2 g。

1.1.2 實驗?zāi)[瘤對象 由中國科學(xué)院上海藥物研究所提供的瘤株小鼠Heps肝癌細胞株（瘤源腹水保種）。此型細胞株已經(jīng)江蘇省腫瘤防治研究所傳代保種。

1.1.3 實驗儀器 東南大學(xué)提供的HDJ-500型高功率氦氖蒸汽激光器。輸出端接內(nèi)徑400 μm的石英導(dǎo)光纖維，輸出紅光的中心波長為632.8 nm。實驗用光敏劑為第二軍醫(yī)大學(xué)提供的癌光啉（Photocarcinorin，PSD-007）注射液。

1.1.4 其余實驗所需 上海生物制品研究所提供的試劑卡介苗（Bacillus Calmette Guerin，BCG）。實驗用試劑盒為上海晶美公司提供的小鼠白介素（interleukin，IL）-1β酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。

1.2 實驗主要方法

1.2.1 小鼠移植性Heps實體瘤模型的建立無菌操作取傳代保種8 d、生長旺盛且無破潰的Heps荷瘤小鼠的腹水，臺盼藍拒染活細胞記數(shù)法計數(shù)，活瘤細胞超過90%。用生理鹽水注射液按1：3～5的比例制成腫瘤細胞懸液，計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞濃度為1×107/ml，取0.2 ml接種于ICR小鼠右后背側(cè)皮下。

1.2.2 分組接種腫瘤后第7 d，待移植瘤長至直徑0.8～1.2 cm時，將模型鼠隨機分為4組，每組均24只小鼠。（1）光動力學(xué)療法（PDT）組：腫瘤局部進行光動力學(xué)治療；（2）聯(lián)合（PDT＋BCG）組：于PDT后即時行腫瘤局部注射BCG 1×107CFU[2]；（3）BCG組：腫瘤局部注射BCG1×107CFU，；（4）對照（C）組：未進行任何處理。

1.2.3 PDT方法照光前每只小鼠尾靜脈注入PSD-007 20 mg/kg體重，避光7 h。8%硫化鈉腫瘤局部脫毛，暴露照光區(qū)。腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg體重，麻醉后小鼠側(cè)臥于照射板上，紅光照射腫瘤局部。調(diào)整光斑直徑2 cm，平切光纖頭距腫瘤3 cm。功率密度190～200 mW/cm2，能量密度170～180 J/cm2。

1.2.4 腫瘤體積瘤結(jié)節(jié)長出后隔日用游標卡尺測量瘤體長徑（a）和瘤體的橫徑（b），按公式腫瘤體積計算，比較各組腫瘤的生長情況。

1.2.5 ELISA測定各組荷瘤小鼠血清中細胞因子的含量各組于治療后2 h、24 h以及7 d分批取6只小鼠，摘眼球取血，分離血清后，按ELISA試劑盒說明書測定血清中細胞因子IL-1β的濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均為計量資料，實驗數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標準差）表示，采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。兩樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)間的比較采用q檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01認為有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠Heps肝癌移植瘤對不同治療的反應(yīng)以及瘤體的消長情況

PDT組和聯(lián)合組光照后2 h瘤體表面充血發(fā)紅；光照后24 h瘤體表面變黑，部分瘤體表面結(jié)痂；光照后7 d，瘤體表面結(jié)痂部分脫落，肉眼見瘤體退縮。其中聯(lián)合組腫瘤體積的縮小較單純PDT組更為迅速而明顯。BCG組隨移植后的時間延長，腫瘤體積逐漸增大，但其增長速度較對照組明顯減慢。

圖1 IL-1β標準曲線

表1 各治療組移植瘤體積的變化[cm3，（±s），n=24]

表1 各治療組移植瘤體積的變化[cm3，（±s），n=24]

注：#與對照組和BCG組相比，P＜0.01；*與對照組相比，P＜0.01；▲與PDT組相比，P＜0.05

治療后2 h 24 h 7 d對照組 0.45±0.02 0.45±0.02 0.77±0.11 2.41±0.39 PDT組 0.47±0.05 0.47±0.05 0.58±0.07 0.43±0.05#BCG組 0.47±0.07 0.47±0.07 0.69±0.11 1.68±0.24* PDT＋ 0.51±0.03 0.51±0.03 0.63±0.03 0.33±0.07#▲BCG組組別 治療前

表2 荷瘤小鼠治療后血清中IL-1β的變化[pg/ml，（±s）]

表2 荷瘤小鼠治療后血清中IL-1β的變化[pg/ml，（±s）]

注：#與C組相比，P＜0.01，▲與BCG組相比，P＜0.01，*與PDT組相比，P＜0.05

組別 治療后 IL-1β C組 2 h 30.50±6.28 24 h 25.61±3.75 7 d 25.03±3.01 BCG組 2 h 61.85±7.72#24 h 97.25±9.83#7 d 48.08±6.46#PDT組 2 h 210.53±17.05#▲24 h 415.45±25.35#▲7 d 219.35±17.16#▲PDT＋BCG組 2 h 243.77±18.42#▲24 h 534.52±28.52#▲* 7 d 316.27±16.64#▲*

各組小鼠治療前和治療后的移植瘤體積見表1。PDT組、聯(lián)合組以及BCG組治療后7 d的腫瘤體積較對照組均明顯縮?。≒ ＜0.01），PDT組、聯(lián)合組治療后7 d的腫瘤體積較BCG組均明顯縮?。≒＜0.01），聯(lián)合組治療后7 d的腫瘤體積較單純PDT組縮?。≒＜0.05）。

2.2 荷瘤小鼠血清細胞因子IL-1β檢測結(jié)果

根據(jù)測得的各組OD值、標準曲線，見圖1，以及各組待測血清樣本稀釋倍數(shù)，計算得到各組荷瘤小鼠血清中IL-1β濃度，結(jié)果見表2。PDT后不同時間，血清中IL-1β的含量均有不同程度的增高。以治療后不同時間點為橫坐標，血清中細胞因子TNF-α的濃度為縱坐標，把各組荷瘤小鼠治療后不同時間點血清中IL-1β濃度繪成直方圖，見圖2。

圖2 各組IL-1β濃度的三維柱形圖（以各組均數(shù)表示）

3 討論

根據(jù)已有研究實驗研究成果判斷，PDT在針對性殺治腫瘤細胞和破壞腫瘤微血管方面具有明顯作用，同時能夠有效激發(fā)存留于宿主內(nèi)的抗腫瘤免疫效應(yīng)，新的研究成果已經(jīng)證明由此產(chǎn)生的免疫作用對遏制腫瘤發(fā)揮了積極作用。實驗結(jié)果顯示PDT在破壞腫瘤細胞、殺傷腫瘤微血管和腫瘤間質(zhì)的同時，能夠造成幾種特定免疫分子數(shù)量的改變，從而引起不同的整體和局部性反應(yīng)。Seyo等在文獻[3]中對膀胱癌患者實施PDT以后，IL-1β從尿液中被檢出，在一定程度上提供了IL-1β分子是由PDT過程所激發(fā)產(chǎn)生的證據(jù)。

本實驗結(jié)果顯示，PDT后2 h、24 h以及7 d，荷瘤小鼠血清中IL-1β的含量均有不同程度的增高。這提示：PDT后，光毒性損傷誘導(dǎo)了荷瘤小鼠體內(nèi)大量釋放細胞因子IL-1β。

IL-1β被稱為前炎癥細胞因子（proinflammatory cytokine），是啟動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細胞因子[4]，可進一步介導(dǎo)巨噬細胞和中性粒細胞向腫瘤部位浸潤，實現(xiàn)免疫應(yīng)答反應(yīng)的正反饋。PDT后，荷瘤小鼠血清中IL-1β的水平高于荷瘤對照組，說明PDT能夠促進荷瘤小鼠分泌細胞因子IL-1β，從而提高荷瘤小鼠免疫效應(yīng)，促進抗腫瘤效用。

采取結(jié)合各種治療手段的綜合療法是被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)界普遍承認的治療腫瘤的可行方法，也符合目前癌癥治療研究的新趨勢。PDT雖然在抗癌抑癌方面有一定療效，但是限于局部療法受制于穿透深度的限制，治療作用在遇到大型瘤體或者浸潤過深的實體瘤體時發(fā)揮有限。為了強化PDT的治療效果，部分研究者將手術(shù)、化療、放療等醫(yī)學(xué)方法與PDT相結(jié)合[5-7]，意圖提高PDT的治療范圍，從而將綜合治療方法的療效發(fā)揮到更高的水平。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在腫瘤治療的快速進步，融合了PDT療法和免疫療法各自優(yōu)勢的光動力免疫療法（photodynamic immunotherapy，PDIT）逐漸擴大應(yīng)用，在醫(yī)學(xué)界引起了廣泛關(guān)注[8]。

TNF-α是一種對多種腫瘤細胞都有突出治療效用的制劑，大量的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將誘導(dǎo)單核細胞分泌的TNF-α免疫制劑與PDT療法聯(lián)合應(yīng)用，能有效殺傷和抑制腫瘤細胞的發(fā)展和生成，產(chǎn)生的更強的協(xié)同治療效果。David等在文獻[9]中研究雙低劑量的二甲基磺醌醋酸（5，6-dimethylxanthenone-4-acetic acid，DMXAA）和PDT的協(xié)同效應(yīng)時得出，正常組織的損傷程度、腫瘤復(fù)發(fā)率呈明顯下降趨勢的結(jié)果，而用于抑制血管生成的細胞因子DMXAA正是激發(fā)TNF-α的源頭。

本實驗所用的免疫佐劑是已經(jīng)在醫(yī)學(xué)界得到大范圍應(yīng)用的BCG，它的主要用途為減毒活疫苗。1935年，自Sweden的Holmgree首次用BCG治療癌癥算起，到上世紀60年代，BCG通過不斷發(fā)展已經(jīng)成為一種成熟的治療癌癥的方法。本文實驗中BCG組荷瘤小鼠血清中的TNF-α數(shù)量發(fā)生了明顯增高，提示BCG可誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α免疫制劑。

實驗組中BCG＋PDT協(xié)同治療法對小鼠肝癌移植瘤進行治療，結(jié)果顯示與單純PDT組相比，BCG+PDT協(xié)同組的腫瘤體積發(fā)生了顯著減小，荷瘤小鼠血清中TNF-α濃度比PDT組有顯著提高。這提示了局部注射BCG和PDT的綜合療法能增強TNF-α的產(chǎn)生數(shù)量，而從強化治療腫瘤病變效果。

由實驗結(jié)果可以看出，荷瘤小鼠肝癌移植瘤的體積在實施PDT后發(fā)生顯著減小，血清TNF-α濃度得到提高，提示實施PDT以后在原發(fā)灶被大范圍殺傷，機體免疫力獲得提升。加入注射BCG之后，TNF-α濃度比PDT組中有了顯著提高，提示PDIT的治療效應(yīng)要優(yōu)于單純PDT，荷瘤宿主免疫力獲得大幅提高，在一定程度上驗證了肝癌綜合療法的優(yōu)越性。在下一步的臨床應(yīng)用中要注意加強研究，為優(yōu)化PDT治療方法提供更多更有效的抗癌和腫瘤抑制手段。

[1]Dougherty TJ，Gomer CJ，Henderson BW，et al. Photodynamic Therapy[J]. Journal of the National Cancer Institute，1998，90（12）：889-905．

[2]Korbelik M，Sun J，Posakony JJ. Interaction between photodynamic therapy and BCG immunotherapy responsible for the reduced recurrence of treated mouse tumor[J]. PhotochemPhotobiol，2001，73（4）：403-409．

[3]Nseyo UO，Whalen RK，Duncan MR，et al. Urinary cytokines following photodynamic therapy for bladder cancer. A preliminary report[J]. Urology，1990，36（2）：167-171．

[4]陳慰峰. 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：45-356．

[5]Yom SS，Busch TM，F(xiàn)riedberg JS，et al. Elevated serum cytokine levels in mesothlioma patients who have undergone pleurectomy or extra pleural pneumonectomy and adjuvant intraoperative photodynamic therapy[J]. PhotochemPhotobiol，2003，78（1）：75-82．

[6]張南征，李吉華，邵艾莉，等. 與局部化療聯(lián)合治療上消化道腫瘤的療效觀察[J]. 中國激光醫(yī)學(xué)雜志，1994，3（2）：91-93．

[7]Zhang NZ，Zhu Y，Pan W，et al. Photodynamic therapy combined with local chemotherapy for treatment of advanced esophagocardiac carcinoma[J]. Photodiagnosis and photodynamic therapy，2007，4（1）：60-64．

[8]周傳農(nóng)，謝樹森，李暉. 光動力免疫治療-腫瘤治療新探索[J].中國激光醫(yī)學(xué)雜志，2000（9）：196.

[9]Bellnier DA，Gollnick SO，Camacho SH，et al．Treatment with the tumor necrosis factor-inducing drug 5, 6-dimethylxanthenone-4-acetic acid enhances the antitumor activity of the photodynamic therapy of RIF-1 mouse tumors[J]. Cancer Res.，2003，63（22）：7584-7590.

Experimental Studies on Photodynamic Therapy’s Effect

XU Jing1SUN Xinmei2TAO Lu1, 1 Outpatient department, Clinic of Air Force Logistics College, Xuzhou 221000, China, 2 Outpatient department, Clinic of Troop 95958, Shanghai 200120, China

ObjectiveTo invest the local immune effect of photodynamic therapy (PDT) and the effect of PDT combined with local injection of BCG.Methods96 tumor-bearing models were established with liver carcinomas subcutaneously transplanted in mice. The mice were divided randomly into four groups: control group, PDT group, BCG group, and PDT plus BCG group. Tumor size was measured in each group. IL-1β was measured with enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) kit.Results(1) The tumor volume of PDT group, BCG group, and PDT plus BCG group was smaller than that of the control group on the 7 days after therapy (P＜0.01). The tumor volume of PDT plus BCG group was smaller than that of the PDT group on the 7 days (P＜0.05). (2) At 2 hours, 24 hours and 7 days after therapy, ELISA results showed that compared with control group and immune therapy only group, the abilities of PDT group and PDIT group to secrete cell factors IL-1β increased obviously. And there was statistic significance (P＜0.01). At 24 hours and 7 days after therapy, ELISA results showed that compared with PDT only group, the abilities of PDIT group to secrete cell factors IL-1β increased obviously. And there was statistic significance (P＜0.05).ConclusionPDT had the inhibitory effect on tumor growth of mice Heps cell line, and spontaneously could induce the systemic immune effects. The therapeutic effects of PDT combined with BCG were superior to PDT only and BCG only.

Heps liver cell line, Photodynamic therapy, Bacillus calmette guerin, Cell factors, Mouse

R730.5

A

1674-9308（2015）32-0204-04

10.3969/j.issn.1674-9308.2015.32.152

1 221000徐州，空軍勤務(wù)學(xué)院門診部；2 200120上海，95958部隊門診部