黃友如 齊 斌 王立梅 陳義勇 朱益波 崔竹梅

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，蘇州 215500）

重水環(huán)境下的氧化大豆蛋白Raman光譜分析

黃友如 齊 斌 王立梅 陳義勇 朱益波 崔竹梅

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，蘇州 215500）

應(yīng)用Raman光譜分析了不同亞油酸濃度下脂肪氧合酶催化誘導(dǎo)產(chǎn)生的大豆蛋白聚集體的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，當(dāng)模擬反應(yīng)體系中亞油酸濃度在3.14～6.09 mmol／L范圍之間時，拉曼光譜中歸屬于CH和CH2彎曲振動的譜帶強(qiáng)度增強(qiáng)，而歸屬于位于非極性環(huán)境中的色氨酸和酪氨酸殘基的譜帶強(qiáng)度減弱；當(dāng)亞油酸濃度達(dá)到7.51 mmol／L時，則出現(xiàn)相反的結(jié)果，這表明大豆蛋白質(zhì)的聚集涉及到疏水相互作用。此外，在蛋白質(zhì)拉曼光譜中還觀察到胱氨酸殘基二硫鍵的伸縮振動變化。二級結(jié)構(gòu)分析表明反應(yīng)后大豆蛋白α-螺旋減少，β-折疊增加。

大豆蛋白 脂肪氧合酶 亞油酸 氧化性修飾 Raman

通過建立由脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）、亞油酸（linoleic acid，LA）和低脂質(zhì)含量大豆蛋白（lipid-reduced soy proteins，LRSP）組成的三元模擬體系，結(jié)合傅里葉變換紅外黃友如等［1］研究了不同亞油酸濃度下脂肪氧合酶催化誘導(dǎo)產(chǎn)生的大豆蛋白聚集體的部分結(jié)構(gòu)變化。與紅外光譜一樣，Raman光譜也是振動光譜，它們是研究分子間能級躍遷的兩種互補(bǔ)方法。有些分子能級躍遷只具有紅外活性，而另一些只具有Raman活性，還有一些躍遷既有紅外活性，又具有Raman活性。紅外光譜主要反映的是分子振動中偶極距的變化，而Raman光譜則主要體現(xiàn)了分子極化率的變化情況，二者反映了蛋白質(zhì)和多肽中不同側(cè)面的信息。利用蛋白質(zhì)的Raman光譜可以得到有關(guān)其氨基酸組成、二級結(jié)構(gòu)、主鏈構(gòu)象、側(cè)鏈構(gòu)象、電離化基團(tuán)和化學(xué)鍵的構(gòu)象、殘基內(nèi)氫鍵變化方面的信息［2］。這些信息的獲得使得對大豆蛋白完整結(jié)構(gòu)的分析有了可能，保證觀察到的結(jié)構(gòu)特征反映的是大豆蛋白的真實(shí)狀態(tài)。

本試驗(yàn)應(yīng)用Raman光譜進(jìn)一步對大豆蛋白聚集體在不同狀態(tài)下的微區(qū)結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定分析，研究不同LA濃度下LOX誘導(dǎo)聚集過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，揭示大豆蛋白聚集體形成的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

低溫脫脂豆粕：山東禹王實(shí)業(yè)有限公司植物油廠；脂肪氧合酶（LOX I-B，70 800 U／mg）：Sigma公司；亞油酸（色譜純，含量≥99.0%）：Sigma公司；重水（重氫含量：99.8%，pD6.8）：北京化工廠；其他試劑均為分析純；LabRam-1B型顯微拉曼光譜儀：法國Dilor公司。

低脂質(zhì)含量大豆蛋白（lipid-reduced soy proteins，LRSP）：自制［1］。

1.2 用于結(jié)構(gòu)分析的樣品制備

底物L(fēng)A溶液和LOX酶液：自制［1］。將LRSP溶于去離子水中配制成5%的大豆蛋白溶液，用1.0 mol／L NaOH調(diào) pH 9.0。

模擬反應(yīng)體系由LOX、LA和LRSP組成（表1），將其反應(yīng)體系放入30℃的水浴中分別恒溫振蕩培養(yǎng)6.0 h后取出，冰浴冷卻至0℃后用1.0 mol／L HCl調(diào) pH值至 4.5酸沉，離心（11 000r／min，30 min）取沉淀水洗，水洗后的蛋白沉淀分散于去離子水中并用1.0 mol／L NaOH調(diào)pH值至7.0。所得蛋白（Reacted soybean proteins，RSP）溶液分別冷凍干燥后粉碎并過80目標(biāo)準(zhǔn)篩。

表1 模擬反應(yīng)體系的組成

1.3 Raman光譜測定

樣品處理：將蛋白樣品分散在重水中配制成100 mg／mL的溶液，分析前在5℃下貯藏48 h，以使H／D能夠完全置換。試驗(yàn)條件：法國Dilor公司LabRam-1B型顯微拉曼光譜儀，He-Ne激光器，波長為632.8 nm，功率6.4 mW，積分時間100 s，室溫下測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 巰基和二硫鍵的分析

在聚集體形成過程中可能發(fā)生二硫鍵的形成與交換，前面在聚集體的巰基和二硫鍵含量的測定中采用了間接化學(xué)分析的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照樣品相比較，在大豆蛋白制備的模擬體系中，同時添加LA和LOX制備的大豆蛋白，其游離巰基和總的巰基與二硫鍵的含量都下降了［3］。

在蛋白質(zhì)拉曼光譜中，500～550 cm-1區(qū)域的峰通常與二硫鍵C—C—S—S—C—C結(jié)構(gòu)單元的S—S伸縮振動模式有關(guān)［4-5］。這里拉曼光譜的直接分析清晰地表明（圖1，表2），反應(yīng)后大豆蛋白在二硫鍵和S-S伸縮振動區(qū)域（500～535 cm-1）均發(fā)生了變化。對照樣品RSP1的譜峰位于525 cm-1，其相對強(qiáng)度僅為0.07，相比之下，RSP2和RSP3的譜峰發(fā)生了位移，分別在516 cm-1和536 cm-1各出現(xiàn)一個峰，且相對強(qiáng)度隨反應(yīng)程度的增加而增加。這種位移說明聚集體中二硫鍵構(gòu)象已由對照樣品的全旁-旁-反式構(gòu)象（gauche-gauche-trans）轉(zhuǎn)為旁式（gauche）與反-旁-反式（RSP2和RSP3）并存的構(gòu)象。表明此類蛋白質(zhì)胱氨酸殘基周圍的構(gòu)象已發(fā)生了變化，同時也說明RSP2和RSP3聚集體的形成與二硫鍵的交聯(lián)分不開。其外，發(fā)生在750 cm-1的半胱氨酸殘基C-S振動譜峰的變化也可說明這一點(diǎn)，與對照樣品相比，RSP2和RSP3在750 cm-1處的譜峰強(qiáng)度降低，說明反應(yīng)后樣品中的半胱氨酸（即游離巰基）含量減少。

圖1 LOX催化的LA氧化對大豆蛋白拉曼光譜的影響

同樣RSP4和RSP5的譜峰也發(fā)生了位移，其中心位于516 cm-1，相對強(qiáng)度隨反應(yīng)程度的增加而減少；另外RSP5樣品在490 cm-1和534 cm-1各出現(xiàn)一個相對強(qiáng)度較低的額外峰。這種位移說明RSP4和RSP5聚集體中二硫鍵構(gòu)象已由對照樣品的全旁-旁-反式構(gòu)象（gauche-gauche-trans）轉(zhuǎn)為全旁式構(gòu)象（gauche，RSP4）或旁式（gauche）與反 -旁 -反式（trans-gauche-trans，RSP5）并存的構(gòu)象。這表明此類蛋白質(zhì)胱氨酸殘基周圍的構(gòu)象已發(fā)生了變化，同時也說明RSP4和RSP5聚集體的形成也涉及二硫鍵的交聯(lián)，但隨著反應(yīng)程度的增加，樣品中二硫鍵的含量在減少。至于游離巰基的變化從750 cm-1的半胱氨酸殘基C-S振動譜峰的變化可看出，與對照樣品相比，RSP4和RSP5聚集體在750 cm-1處的譜峰消失，說明反應(yīng)后該樣品中的半胱氨酸（即游離巰基）殘基幾乎沒有了。結(jié)合前面的化學(xué)分析可知［3］，二硫鍵含量的減少與游離巰基的消失可能是巰基基團(tuán)的進(jìn)一步氧化造成的。

雖然二硫鍵的形成并不規(guī)定多肽鏈的折疊，然而一旦蛋白質(zhì)采取了它的三維結(jié)構(gòu)則二硫鍵的形成將對此構(gòu)象起穩(wěn)定作用［2］。反應(yīng)后大豆蛋白巰基與二硫鍵含量的變化，反映了大豆蛋白聚集體的形成與蛋白質(zhì)的氧化程度密切相關(guān)。

2.2 芳族氨基酸的分析

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)后的樣品其芳族氨基酸殘基暴露的程度發(fā)生了變化，這表明聚集體的形成涉及疏水相互作用。表3為重水溶液中大豆蛋白芳族氨基酸的Raman譜峰峰位、相對強(qiáng)度及譜峰指認(rèn)。在751、880、1 555和1 581 cm-1附近的峰是由于色氨酸吲哚環(huán)振動引起；與對照樣品 RSP1相比，RSP2、RSP3和RSP4對應(yīng)的峰強(qiáng)度減弱，它表明此類樣品中的色氨酸殘基在反應(yīng)后較多地暴露出來。在1 333～1 378 cm-1之間的兩個色氨酸峰，除了1 344 cm-1峰強(qiáng)度沒有發(fā)生變化外，另一個1 363cm-1附近峰的強(qiáng)度在反應(yīng)后的樣品中同樣減弱了，結(jié)果使得兩峰之間的波谷變深；這再次證明樣品RSP2、RSP3和RSP4中色氨酸周圍的疏水環(huán)境變?nèi)趿耍? 363 cm-1峰強(qiáng)則Trp趨向于埋藏，弱則暴露［8］）。酪氨酸殘基也有類似的變化，與對照樣品相比，RSP2和RSP4樣品在643、830、853、1 208和1 326 cm-1的幾個酪氨酸特征峰的強(qiáng)度均減弱了；不同的是，樣品RSP3酪氨酸特征峰的強(qiáng)度反而增強(qiáng)了。酪氨酸峰在850和830 cm-1處的強(qiáng)度之比值（I850／I830），對氫鍵的性質(zhì)或酚羥基離子化的狀態(tài)十分敏感，它已被用來鑒定酪氨酸組分埋藏和暴露的程度［9］。與對照樣品RSP1相比（0.76），RSP2、RSP3和RSP4的酪氨酸峰在850和830 cm-1處的強(qiáng)度之比值（I850／I830）均都增加了（RSP2、0.81；RSP3，0.77；RSP4，0.89）；這表明維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的氫鍵受到了破壞，原來埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的酪氨酸氨基酸殘基暴露于分子的表面，并作為氫鍵的供體或受體與水相互作用［8，10-12］。氫鍵在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中起著極其重要的作用［2］。通常大多數(shù)蛋白質(zhì)所采取的折疊策略是使主鏈肽基之間形成最大數(shù)目的分子內(nèi)氫鍵（如α-螺旋，β-折疊片），與此同時保持大多數(shù)能成氫鍵的側(cè)鏈處于蛋白質(zhì)分子的表面將與水相互作用。RSP2、RSP3和RSP4氫鍵的變化反映此類蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化；疏水基團(tuán)的暴露使得蛋白質(zhì)的表面疏水性增強(qiáng)了。

表2 重水溶液中大豆蛋白巰基和二硫鍵的Raman譜峰峰位、相對強(qiáng)度及譜峰指認(rèn)

表3 重水溶液中大豆蛋白芳族氨基酸的Raman譜峰峰位、相對強(qiáng)度及譜峰指認(rèn)

與對照樣品 RSP1相比，RSP5樣品在574和1 582 cm-1兩個峰的強(qiáng)度較大，表明反應(yīng)后樣品中的色氨酸殘基大多埋藏在蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部或者說色氨酸周圍的疏水環(huán)境增強(qiáng)了。值得注意的是色氨酸的其他特征峰的強(qiáng)度（如751，880，1 344，1 362和1 555 cm-1）幾乎沒有變化，甚至減弱了。酪氨酸殘基也有類似的變化，與對照樣品相比，RSP5樣品在1 206和1 327 cm-1處的峰強(qiáng)度增強(qiáng)，而在643、831和853 cm-1處的峰強(qiáng)度卻減弱了。此外，與RSP1相比（0.76），在LA和LOX共同存在的反應(yīng)情況下，RSP5（0.65）的酪氨酸峰在850和830 cm-1處的強(qiáng)度之比值（I850／I830）降低了；這表明由于 LOX誘導(dǎo)的LA氧化產(chǎn)物與大豆蛋白的相互作用增強(qiáng)，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水性殘基進(jìn)一步埋藏在分子的內(nèi)部，蛋白質(zhì)的表面疏水性降低。

疏水相互作用還涉及到脂族氨基酸的疏水基團(tuán)，與對照樣品相比，RSP2、RSP3和RSP5在1 316和1 450 cm-1附近的峰強(qiáng)度略有增加（表4），前者為CH彎曲振動，后者為CH2與CH3彎曲振動。不同的是RSP4樣品在該區(qū)域的峰強(qiáng)度均明顯降低了（表4）。這些結(jié)果表明，由LOX誘導(dǎo)氧化LA和大豆蛋白反應(yīng)的結(jié)果促進(jìn)了芳族和脂族氨基酸殘基的相互作用，促使反應(yīng)后的大豆蛋白通過疏水相互作用產(chǎn)生聚集。

2.3 二級結(jié)構(gòu)的分析

以上是對蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)振動模式的指認(rèn)，下面將著力討論酰胺帶的變化，考察LOX催化的LA氧化對大豆蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響。

表5為溶于重水溶液的大豆蛋白拉曼光譜酰胺III′的譜峰峰位、相對強(qiáng)度及譜峰指認(rèn)。相比之下，大豆蛋白拉曼光譜的酰胺I′較弱，沒有酰胺III′那么顯著，因此這里僅討論酰胺III′。

與對照樣品RSP1相比，在1 050～1 082 cm-1之間對構(gòu)象敏感的代表C—C，═C O和C—N骨架振動的各峰強(qiáng)度降低了，說明反應(yīng)后的大豆蛋白，其結(jié)構(gòu)已發(fā)生了改變。RSP2在935和947 cm-1附近的酰胺III′的強(qiáng)度沒有變化，RSP4和5在935和947 cm-1附近的酰胺III′的強(qiáng)度都明顯減少了，表明此類大豆蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)在反應(yīng)后減少了。不同的是，RSP3樣品在935和947 cm-1附近的酰胺III′帶的強(qiáng)度卻略有增加。與此同時，歸屬于典型β-折疊結(jié)構(gòu)的酰胺III′帶990 cm-1附近峰的強(qiáng)度明顯增加（RSP2除外）。這些結(jié)果說明大豆蛋白與LA的相互作用可能是由于LOX誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基攻擊，破壞了大豆蛋白相鄰螺圈之間形成的氫鍵，導(dǎo)致α-螺旋的展開以及隨后的分子相互作用，從而產(chǎn)生較多的β-折疊結(jié)構(gòu)。

表4 重水溶液中大豆蛋白Raman光譜C-H彎曲振動區(qū)域的譜峰峰位、相對強(qiáng)度及譜峰指認(rèn)

表5 重水溶液中大豆蛋白Raman光譜C-C和C-N、酰胺III′帶等的譜峰峰位、相對強(qiáng)度及譜峰指認(rèn)

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用Raman光譜對大豆蛋白聚集體在不同狀態(tài)下的微區(qū)結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測定分析，結(jié)果表明，無論是溶液中的蛋白質(zhì)抑或是LOX催化LA氧化與蛋白質(zhì)相互作用所形成的聚集體，拉曼光譜均給出許多有價值和詳細(xì)的信息，包括與疏水相互作用有關(guān)的芳族和脂族氨基酸側(cè)鏈的暴露程度、二硫鍵的變化以及蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)信息等?；诶庾V的分析，可知由LOX催化LA氧化所誘導(dǎo)的大豆蛋白聚集行為包括疏水相互作用、氫鍵、二級結(jié)構(gòu)的改變以及對反應(yīng)后蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性有貢獻(xiàn)作用的二硫鍵變化。

［1］黃友如，華欲飛，張根華，等.重水環(huán)境下的氧化大豆蛋白傅里葉變換紅外（FT-IR）分析［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2010，25（5）：19-23，29

［2］陶慰孫，李惟，姜涌明.蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)［M］.第二版.北京：高等教育出版社，1995：247-254，260-263

［3］黃友如，華欲飛，裘愛泳.脂質(zhì)氧化誘導(dǎo)的大豆蛋白質(zhì)聚集機(jī)理的研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào).2006，21（1）：80-87

［4］Yu N T，Liu C S.Laser raman spectra of native and denatured insulin in the solid state［J］.Journal of the American Chemical Society，1972，94（9）：3250-3251

［5］Tu A T.Raman spectroscopy in biology：principles＆applications［M］.New York：John Wiley＆Sons，Inc.，1982：91-96

［6］Liu C S，Culver J，O’Shea D C.A preliminary raman spectroscopic study of native zinc-insulin crystals［J］.Biochimica Biophysica Acta，1972，263（1）：1-6

［7］Miura T，Satoh T，Takeuchi H.Role of metal-ligand coordination in the folding pathway of zinc finger peptides［J］.Biochimica Biophysica Acta，1998，1384（1）：171-179

［8］Howell N，Li-Chan E.Elucidation of interactions of lysozyme with whey proteins by ramanspectroscopy［J］.International Journal of Food Science and Technology，1996，31（5）：439-451

［9］Carey P R.Biochemical applications of raman and resonance ramanspectroscopies［M］.New York：Academic Press，1982：71-98

［10］Parker F S.Applications of infrared，raman and resonance spectroscopy in biochemistry［M］.New York：Plenum Press，1983：1-39，83-154，451-480

［11］Ogawa M，Nakamura S，An H，et al.Raman spectroscopy study of changes in fish actomyosin during setting［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47（8）：3309-3318

［12］Careche M，Li-Chan E Y C.Structural changes in cod myosin after modification with formaldehyde or frozen storage［J］.Journal of Food Science，1997，62（4）：717-723

［13］Overman SA，Thomas G J.Amide modes of theα-helix：Raman spectroscopy of filamentous virus fd containing peptide13C and2H labels in coat protein subunits［J］.Biochemistry，1998，37（16）：5654-5665

［14］Brunner H，Holz M.Raman studies of conformation of the basic pancreatic trypsin inhibitor［J］.Biochimica Biophysica Acta，1975，379（2）：408-417

［15］Aubrey K L，Thomas G J.Raman spectroscopy of filamentous bacterlophage Ff（fd，M13，fl）incorporating specifically-deuterated alanine and tryptophan side chains.Assignments and structural interpretation［J］.Biophysical Journal，1991，60（6）：1337-1349

［16］Cavatorta F，F(xiàn)ontana M P，Vecli A.Raman spectroscopy of protein-water interactions in aqueous solutions［J］.The Journal of Chemical Physics，1976，65（9）：3635-3640

［17］Overman SA，Thomas GJ.Raman spectroscopy of the filamentous virus Ff（fd，fl，M13）：structural interpretation for coat protein aromatics［J］.Biochemistry，1995，34（16）：5400-5451

［18］Yu N T.Raman spectroscopy：A conformational probe in biochemistry［J］.CRC Critical Reviews in Biochemistry，1977，4（3）：229-280

［19］Chen M，Lord R G，Mendelsohn R.Laser-excitedraman spectroscopy of biomolecules.IV.Thermal denaturation of aqueous lysozyme［J］.Biochimica Biophysica Acta，1973，328（2）：252-260.

Raman Spectroscopy Analysis of Oxidative Soybean Proteins in D2O

Huang Youru Qi Bin Wang Limei Chen Yiyong Zhu Yibo Cui Zhumei
（School of Biological Science and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Suzhou 215500）

The molecular structure of soybean protein aggregates formed with different linoleic acid concentration catalyzed by lipoxygenase have been examined by Raman spectral analysis.When the linoleic acid concentration in model system between 3.14 and 6.09 mmol／L，reacted soybean proteins had an involvement of hydrophobic interactions by intensification of spectral bands assigned to CH＆CH2 bending vibrations and decreased in the intensity of bands assigned to tryptophan and tyrosine residued in a nonpolar environment.When the linoleic acid concentration reached 7.51 mmol／L，the contrary results could be observed in the model system.Changes in the disulphide stretching vibrations of cystine residues also have been observed by Raman spectral analysis.Secondary structure analysis demonstrated that the interacting with linoleic acid catalyzed by lipoxygenase resulted in a decreased proportion of α-helix structures and increased proportion ofβ-sheet structures.

soybean proteins，lipoxygenase，linoleic acid，oxidative modification，Raman

TS201.2+1；TQ645.9+9

A

1003-0174（2015）02-0112-06

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃（2012BAD34B04-1，2013AA102203-03），江蘇省高校自然科學(xué)研究（10KJB550001），蘇州市科技計(jì)劃（SYN201211）

2013-12-12

黃友如，男，1966年出生，副教授，糧食、油脂與植物蛋白工程