張 巖 王安妮 肖軍霞 王世清 姜文利 李玉鵬

（青島市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)質(zhì)量與安全工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109）

低溫射頻等離子體降解乙腈中黃曲霉毒素B1的效果與途徑分析

張 巖 王安妮 肖軍霞 王世清 姜文利 李玉鵬

（青島市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)質(zhì)量與安全工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109）

采用低溫射頻等離子體處理溶解于乙腈中的黃曲霉毒素B1，考察了時(shí)間、等離子體發(fā)射功率、黃曲霉毒素B1初始濃度對(duì)黃曲霉毒素B1降解率的影響，通過(guò)HPLC-MS／MS分析降解產(chǎn)物及其可能的降解途徑。結(jié)果表明，隨著等離子體功率的增大、黃曲霉毒素B1初始濃度的降低，其降解率有增大的趨勢(shì)。200～500μg／L黃曲霉毒素B1經(jīng)120 W等離子體處理150 s以上，黃曲霉毒素B1的降解率可達(dá)95%以上。經(jīng)過(guò)對(duì)比等離子體處理不同時(shí)間后的黃曲霉毒素B1的一級(jí)質(zhì)譜，推測(cè)準(zhǔn)分子離子峰157、299、339為可能的降解產(chǎn)物峰。結(jié)合產(chǎn)物峰的二級(jí)質(zhì)譜碎片信息和黃曲霉毒素B1分子結(jié)構(gòu)中的活性位點(diǎn)，推斷出降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和降解路徑。

低溫射頻等離子體 黃曲霉毒素B1降解率 降解產(chǎn)物

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是一種極其穩(wěn)定的真菌毒素，主要有黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2，是一類結(jié)構(gòu)類似化合物的總稱［1］。1993年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將黃曲霉毒素劃定為I類致癌物，毒性作用靶器官主要為肝臟，能引起肝炎、肝硬化、肝壞死等。其中以黃曲霉毒素B1（AflatoxinsB1，AFB1）的毒性和致癌性最強(qiáng)［2］。AFB1的基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素，分子量312，易溶于乙腈、甲醇、乙醇、氯仿、油，難溶于水，不溶于乙醚、石油醚、己烷［3-5］。

黃曲霉毒素毒性大、分布廣、難去除。目前降解黃曲霉毒素常用的方法主要有化學(xué)法、生物法、輻照法等，但化學(xué)法極易帶來(lái)新的有機(jī)溶劑殘留，生物法則由于工藝復(fù)雜難以推廣，因此，本試驗(yàn)以射頻低溫等離子體作為降解手段，擬研究一種基于物理處理的高效、簡(jiǎn)捷、安全降解黃曲霉毒素的新方法［6-11］。

射頻低溫等離子體是利用高頻高壓使電極周圍的空氣電離而產(chǎn)生的低溫等離子體。由于射頻低溫等離子的放電能量高、放電的范圍大，現(xiàn)在已經(jīng)被應(yīng)用于材料的表面處理和有毒廢物清除和裂解中［12-13］。射頻低溫等離子產(chǎn)生的具有高活性的電子、原子、分子和自由基能與各種有機(jī)、無(wú)機(jī)污染物分子進(jìn)行碰撞和反應(yīng)，使污染物分子鍵斷裂，形成低毒或無(wú)毒的小分子化合物［14-16］。張巖等［17］運(yùn)用等離子體降解水中的黃曲霉毒素 B1，降解率為51.67%。由于黃曲霉毒素B1在乙腈中的溶解性良好，本研究以乙腈為AFB1溶解介質(zhì)，采用射頻低溫等離子體處理AFB1，并通過(guò)HPLC法測(cè)定AFB1含量，同時(shí)用HPLC-MS／MS法分析降解產(chǎn)物，探究等離子體降解乙腈中AFB1的效果與產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)簡(jiǎn)單溶劑體系中毒素降解過(guò)程的深入研究，為在真實(shí)食品體系中研究等離子體降解黃曲霉毒素B1建立研究方法、提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素B1：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙腈（色譜純）：德國(guó)默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

等離子體試驗(yàn)裝置由食品學(xué)院制作，由射頻電源、射頻電源匹配器、等離子體發(fā)生器、真空泵等部分組成，如圖1所示。超高壓液相色譜1290 Infinity噴射流離子聚焦串聯(lián)四極桿6460液質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司；Elmasonic S450H智能超聲波清洗器：德國(guó)艾爾瑪公司。

圖1 低溫射頻等離子體發(fā)生器

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 等離子體處理方法

配制 200、400、500、600、800、1 000μg／L AFB1溶液，置于等離子體發(fā)生器兩電極之間進(jìn)行處理。等離子體處理功率設(shè)定為 80、90、100、110、120 W，每個(gè)處理重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)定未進(jìn)行等離子體處理樣品為對(duì)照組。

1.3.1.1 不同等離子體發(fā)射功率對(duì)黃曲霉毒素B1降解效果的影響

初始濃度為500μg／L的AFB1溶液，置于等離子體發(fā)生器中進(jìn)行處理，射頻電源功率設(shè)定為80、90、100、110、120 W，處理時(shí)間 100 s。

1.3.1.2 不同等離子體處理時(shí)間對(duì)黃曲霉毒素B1降解效果的影響

初始濃度為500μg／L的AFB1溶液，置于等離子體發(fā)生器中，功率設(shè)定為120 W，分別處理50、100、150、200、250 s。

1.3.1.3 不同AFB1初始濃度對(duì)黃曲霉毒素B1降解效果的影響

取200、400、600、800、1 000μg／L的毒素溶液，分別于等離子體發(fā)射功率為120 W下進(jìn)行處理，處理時(shí)間為100 s。

試樣經(jīng)等離子體處理后，經(jīng)HPLC測(cè)定黃曲霉毒素B1含量并計(jì)算降解率。

1.3.2 HPLC測(cè)定AFB1降解率

1.3.2.1 HPLC色譜條件

Agilent液相系統(tǒng)，色譜柱：Waters Symmetry-C18，4.6 mm×25 0 mm，粒度5μm，柱溫：30℃，流動(dòng)相∶乙腈∶水 ＝（30∶70，V／V），流速：1 mL／min，進(jìn)樣量：20μL，熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)：360 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：440 nm。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取衍生后 0.0、0.75、1.5、7.5、37.5、75、150、225、300μg／L AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液 200μL，采用HPLC分析，每個(gè)濃度重復(fù)3次。以圖譜中AFB1的峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度進(jìn)行線性回歸，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝1.753 3x-1.252 6，R2＝0.999 9。

1.3.2.3 AFB1濃度計(jì)算

參照GB／T 5009.23—2006《食品中黃曲霉毒素B1的測(cè)定》［18］，按式（1）計(jì)算樣品中 AFB1的含量。

式中：C為試樣中 AFB1質(zhì)量濃度／μg／L；A為試樣按外標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度／μg／L；f為試樣液衍生后較衍生前的濃縮倍數(shù)。

按式（2）計(jì)算等離子體處理 AFB1的降解率［19］。式中：a為AFB1降解率／%；C為試樣等離子體處理后中 AFB1質(zhì)量濃度／μg／L；C0為試樣中 AFB1質(zhì)量初始濃度／μg／L。

1.3.3 HPLC-MS／MS法分析AFB1降解產(chǎn)物

色譜條件：色譜柱：Agilent SB-C18，2.1 mm×50 mm，粒度1.8μm；柱溫：30℃；流動(dòng)相∶V甲醇∶V水＝60∶40，其中水含 5 mmol／L乙酸銨和 0.2%甲酸；流速：20μL／min；進(jìn)樣量：2μL。

質(zhì)譜條件：離子源：ESI；掃描方式：正離子掃描；載氣溫度300℃；流量6 L／min；鞘氣溫度：300℃；流量12 L／min；掃描范圍：50～400；光電倍增器電壓：400 V；噴霧電壓：45 psi；檢測(cè)方式：MRM模式；毛細(xì)管電壓：4 000 V。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以ˉx±s表示，采用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性及相關(guān)性分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 等離子體發(fā)射功率對(duì)AFB1降解率的影響

由圖2可知，隨著等離子體發(fā)射功率的增大，AFB1降解率有不斷增大的趨勢(shì)。這是由于等離子體發(fā)生器射頻電源的功率增大，所產(chǎn)生等離子體中活性粒子的密度增大，其與溶液中的毒素分子接觸的幾率也隨之增大［20］，毒素降解率越高。

圖2 等離子體發(fā)射功率對(duì)AFB1降解率的影響

2.2 等離子體處理時(shí)間對(duì)AFB1降解率的影響

由圖3可知，500μg／L AFB1經(jīng)120 W等離子體處理150 s以上，AFB1降解率可達(dá)95.0%以上。處理250 s時(shí)AFB1的降解率最高達(dá)到99.8%?？梢?jiàn)，等離子體處理可極有效的降解黃曲霉毒素B1，因此是一種非常有潛力的黃曲霉毒素脫毒方法。

圖3 等離子體處理時(shí)間對(duì)AFB1降解率的影響

2.3 AFB1初始濃度對(duì)其降解率的影響

由圖4可知，AFB1的初始濃度越低，毒素的降解率越高。200μg／L AFB1經(jīng)120 W等離子體處理100 s，降解率已達(dá) 95.39%，而 1 000μg／L AFB1在相同條件下處理100 s，降解率為80.13%。這可能是當(dāng)?shù)入x子功率一定時(shí)，等離子體中產(chǎn)生的活性離子數(shù)目基本上是相同的，溶液的初始濃度越低，則溶質(zhì)分子與活性離子反應(yīng)的幾率越高，反之溶液的初始濃度越高，則溶質(zhì)分子與活性離子反應(yīng)的幾率就越低［21］。

圖4 初始濃度對(duì)AFB1降解率的影響

2.4 HPLC-MS／MS法分析AFB1降解產(chǎn)物

2.4.1 等離子體降解AFB1的產(chǎn)物一級(jí)質(zhì)譜圖

本研究將500μg／LAFB1進(jìn)行不同時(shí)間的處理，等離子體發(fā)射功率設(shè)為120 W，對(duì)降解后的AFB1進(jìn)行HPLC-MS／MS分析，圖5為等離子處理不同時(shí)間的AFB1的質(zhì)譜圖。通過(guò)對(duì)比不同時(shí)間下AFB1的質(zhì)譜圖，分析不同條件下降解產(chǎn)物的異同。

圖5 不同降解時(shí)間下AFB1的一級(jí)質(zhì)譜圖

劉睿杰等［22］運(yùn)用AFB1降解產(chǎn)物的LC-MS圖中物質(zhì)峰的響應(yīng)值體現(xiàn)降解產(chǎn)物的含量，從而得出AFB1在乙腈溶液中降解產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)形成過(guò)程。由圖5和圖6可知，隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，物質(zhì)B、C、D的響應(yīng)值具有一定的規(guī)律性。100 s內(nèi)物質(zhì)峰A（AFB1）響應(yīng)值逐漸降低，B、C的響應(yīng)值逐漸增加，100 s時(shí)B、C響應(yīng)值開(kāi)始降低，出現(xiàn)物質(zhì)峰D，100～150 s內(nèi)B、C響應(yīng)值逐漸降低，而D響應(yīng)值逐漸增加。這表明B、C、D可能是A（AFB1）的降解產(chǎn)物，B、C可能是中間產(chǎn)物。

圖6 等離子處理時(shí)間對(duì)AFB1降解產(chǎn)物響應(yīng)值的影響

2.4.2 等離子體降解AFB1的質(zhì)譜信息

為進(jìn)一步了解降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)以及降解途徑，選取 A（m／z312.9）、B（m／z157.0），C（m／z 299.0），D（m／z339.1）作為母核［23］，碰撞電壓為 30 V做二級(jí)質(zhì)譜鑒定。

AFB1結(jié)構(gòu)中的3個(gè)主要毒性活性位點(diǎn)見(jiàn)圖7，其中呋喃環(huán)8、9位雙鍵部位是黃曲霉毒素形成AFB1-DNA、AFB1-pro的作用位點(diǎn)，是導(dǎo)致基因突變致癌致畸的主要功能基團(tuán)，這點(diǎn)同時(shí)解釋了黃曲霉毒素家族中AFB1毒性最強(qiáng)的原因；另一活性位點(diǎn)是香豆素內(nèi)酯環(huán)部份，這個(gè)位點(diǎn)容易發(fā)生水解，因而成為降解活性位點(diǎn)。同時(shí)，在AFB1環(huán)戊烯酮環(huán)上一些取代基團(tuán)的存在與否也對(duì)黃曲霉毒素的毒性有一定的影響。將母離子A（AFB1）與二級(jí)質(zhì)譜碎片信息匹配，找出AFB1中容易斷裂的“點(diǎn)”，并與其主要毒性活性位點(diǎn)相結(jié)合，為3種降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)推導(dǎo)提供依據(jù)。

圖7 AFB1毒性位點(diǎn)

AFB1與3種降解產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜信息，推斷的 A（m／z 312.9）、B（m／z 157.0），C（m／z299.0），D（m／z339.1）的可能裂解途徑分別見(jiàn)圖8～圖11。

表1 乙腈中AFB1的主要質(zhì)譜碎片信息

圖8 m／z312.9的二級(jí)質(zhì)譜及碎片信息

圖9 m／z157.0的二級(jí)質(zhì)譜及碎片信息

圖10 m／z299.0的二級(jí)質(zhì)譜及碎片信息

圖11 m／z338.9的二級(jí)質(zhì)譜及碎片信息

根據(jù)產(chǎn)物分子量和二級(jí)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，推斷出一種可能的AFB1降解途徑，見(jiàn)圖12。由圖12可知，等離子體降解過(guò)程中AFB1部分發(fā)生分解斷環(huán)反應(yīng)生成產(chǎn)物B、部分在香豆素內(nèi)酯環(huán)部位發(fā)生光消去形成產(chǎn)物C。但B、C僅僅是中間產(chǎn)物，兩者性質(zhì)不穩(wěn)定，隨即發(fā)生聚合生成較穩(wěn)定的物質(zhì)D。產(chǎn)物D結(jié)構(gòu)中，原AFB1呋喃環(huán)雙鍵部位的氫原子被醛基取代，原有毒性功能基團(tuán)被破壞，環(huán)戊烯酮環(huán)2、3位發(fā)生消去反應(yīng)形成雙鍵，推測(cè)產(chǎn)物D的毒性可能發(fā)生改變。

圖12 AFB1的降解途徑

3 結(jié)論

等離子體降解 AFB1效果顯著，200～500μg／L黃曲霉毒素B1經(jīng)120 W等離子體處理150 s以上，黃曲霉毒素B1的降解率可達(dá)95%以上；隨著等離子體功率的增大，AFB1降解率有不斷增大的趨勢(shì)；AFB1溶液初始濃度越低，AFB1降解率越高；通過(guò) HPLCMS／MS分析等離子體處理后的AFB1溶液，結(jié)合一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜，推斷出相對(duì)分子質(zhì)量為156、298、338的3種主要降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及等離子體降解黃曲霉毒素B1的可能的降解路徑。

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Effect and Pathway Analysis of AflatoxinsB1in Degradation of Acetonitrile-Dissolved by Low Temperature Radio Frequency Plasma

Zhang Yan Wang Anni Xiao Junxia Wang Shiqing Jiang Wenli Li Yupeng
（Qingdao Key Lab of Modern Agricultural Quality and Safety Engineering，F(xiàn)ood Science and Engineering College Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109）

The effects of radiation duration，plasma transmit power，aflatoxins B1initial concentration on the degradation rate of aflatoxins B1dissolved in acetonitrile by low temperature radio frequency plasma were studied in this paper.Meanwhile，the possible degradation pathway and degradation products were analyzed by HPLC-MS／MS.The results indicated that the aflatoxins B1degradation rate was increased with elevated transmit power and reduced initial aflatoxins B1concentration.When 200～500μg／L aflatoxins B1was exposed to 120 W plasma for more than 150 s，the degradation rate of aflatoxins B1reached more than 95%.HPLC-MS／MSanalysis of the degradation mixture revealed three major quasi-molecular peaks of 157，299，and 339 respectively after comparing first mass information of aflatoxins B1through different plasma treatment time.The three peaks were proposed corresponding to the degradation products of aflatoxins B1.The degradation products and the pathway were identified using secondary mass fragments information and active site in the structure of aflatoxins B1.

low temperature radio frequency plasma，aflatoxins B1，degradation rate，degradation product

X592

A

1003-0174（2015）02-0080-07

國(guó)家自然科學(xué)基金（31271963）

2013-11-14

張巖，男，1969年出生，副教授，食品安全保藏

王世清，男，1961年出生，教授，食品安全保藏