王衛(wèi)國 朱占齊 吳興泉

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

微波、超高壓處理對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因降解的影響

王衛(wèi)國 朱占齊 吳興泉

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

為了考查不同微波和超高壓處理?xiàng)l件對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因CP4-EPSPS降解的影響。試驗(yàn)對轉(zhuǎn)基因大豆樣品分別微波處理1、2、3、4、5 min或分別用 100、200、300、400、500 MPa超高壓處理 10 min，采用PCR檢測技術(shù)，分析了受處理樣品和未處理樣品中大豆外源基因的降解結(jié)果。結(jié)果表明：在微波處理?xiàng)l件下，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的基因組質(zhì)量濃度隨微波處理時(shí)間的增加而降低，當(dāng)處理時(shí)間超過3 min和5 min后，其質(zhì)量濃度降至9 ng／μL和0 ng／μL，PCR檢測結(jié)果顯示，外源基因已被降解到100 bp以下；超高壓處理?xiàng)l件下，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆基因組質(zhì)量濃度隨著壓力的增加而降低，當(dāng)壓力為500 MPa時(shí)，基因組的質(zhì)量濃度降至40 ng／μL，但仍能檢測到1 512 bp長度的外源基因片段。與超高壓處理相比，微波處理對大豆外源基因的降解更有效。

轉(zhuǎn)基因大豆 CP4-EPSPS 微波 超高壓 降解

抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆，是在傳統(tǒng)大豆中轉(zhuǎn)入外源基因CaMV-35S啟動(dòng)子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS終止子而得到的。在飼料食品加工過程中，采用恰當(dāng)?shù)姆椒▽⑥D(zhuǎn)基因大豆的外源基因充分降解而使其失去活性是近年來廣受關(guān)注的研究課題。

食品或飼料的粉碎、蒸汽處理、酸堿處理、焙烤、煮沸、擠壓膨化等加工方法對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因影響的研究已有部分報(bào)道［1-5］。但微波處理對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因影響的研究較少，而超高壓處理對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因的影響未見報(bào)道。本試驗(yàn)的目的是了解微波處理和超高壓處理?xiàng)l件對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因CP4-EPSPS的降解作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

轉(zhuǎn)基因大豆樣品：鄭州陽光油脂有限公司。

1.1.2 CP4-EPSPS基因擴(kuò)增引物

從Genbank中查詢轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready的P4-EPSPS的基因序列號為 AY125353，其DNA共有 1 946 bp［6］。根據(jù)文獻(xiàn)［7-9］，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增不同長度CP4-EPSPS基因片段的引物（引物序列見表1），所有引物均由英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆外源基因特異性引物序列

1.1.3 試劑

DP-320試劑盒：天根生化科技有限公司；Taq酶、dNTPs、PCR緩沖液、分子量 Marker（100 bp-2 000 bp）：鄭州久是生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

9FQ20錘片粉碎機(jī)：江西紅星機(jī)械廠；梯度PCR儀：德國Bio-metra公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；紫外凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-rad公司；900X2超高壓設(shè)備：包頭軍工廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品水分的測定

按 GB／T 5497—1985［10］測定樣品的水分。

1.2.2 樣品的前處理

挑選籽粒飽滿的大豆，粉碎并過60目篩，備用。

1.2.3 微波處理抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆粉

從經(jīng)過前處理的備用大豆粉中取5個(gè)樣品，每個(gè)樣品量為3.0 g，加入410μL雙蒸水，使大豆粉的含水量達(dá)到20%，放入微波爐中（輸出功率為800 W），按表2方案分別加熱處理，然后冷卻，提取基因組，進(jìn)行質(zhì)量濃度測定和電泳。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

表2 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆微波處理參數(shù)

微波加熱的時(shí)間參考有關(guān)微波加熱大豆的研究文獻(xiàn)確定［11-12］。

1.2.4 超高壓處理抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆粉

常壓密封：取20 g大豆粉溶于100 mL去離子水，經(jīng)真空包裝機(jī)密封備用。

超高壓處理：將常壓真空密封的5個(gè)樣品分別按表3進(jìn)行超高壓處理，每個(gè)樣品恒壓10 min。超高壓處理采用的壓力范圍和時(shí)間參考文獻(xiàn)［13-14］確定。

打開包裝袋，真空抽濾，常溫常壓風(fēng)干后提取基因組，進(jìn)行質(zhì)量濃度測定和電泳。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。

表3 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆超高壓處理參數(shù)

1.2.5 DNA提取

收集經(jīng)各工藝條件加工的樣品以提取DNA。稱取固體樣品60 mg，所有樣品均采用試劑盒進(jìn)行DNA提取，方法按照說明書進(jìn)行。

1.2.6 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆DNA質(zhì)量濃度檢測

采用紫外可見光光度計(jì)法測定抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆基因組的質(zhì)量濃度，按式（1）計(jì)算：

式中：cm為總 DNA質(zhì)量濃度 ng／μL；OD260為紫外可見光光度計(jì)讀數(shù)；λ為50 ng／μL。

1.2.7 PCR擴(kuò)增

研究檢測了抗草甘膦CP4-EPSPS目的基因的4條長度不等的片段，使用未加工轉(zhuǎn)基因大豆外源基因作模板DNA陽性對照，確保試驗(yàn)操作和體系正常，雙蒸水空白對照無檢測產(chǎn)物出現(xiàn)，說明PCR操作過程無污染。

本試驗(yàn)建立和優(yōu)化的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆粉PCR檢測方法均采用相同的PCR反應(yīng)體系，總反應(yīng)體積 50μL，10×Buffer 5μL，dNTPs（10μmol／L）2μL，引物（10μmol／L）2μL，Taq酶1 U，模板 DNA 1μL（約100 ng），加雙蒸水補(bǔ)足至50μL。

反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，4條不同長度片段的PCR檢測反應(yīng)條件如表4所示。

表4 PCR檢測反應(yīng)條件

1.2.8 最低檢測限分析及序列測定

將質(zhì)量濃度約為50 ng／μL的轉(zhuǎn)基因大豆DNA和雙蒸水分別按體積比為1∶1、1∶3、1∶7、5∶95、1∶99的比例充分混合，雙蒸水為空白對照，按1.2.5優(yōu)化的PCR檢測方法進(jìn)行檢測，確定加工處理樣品總DNA的最低檢測限。

將陽性檢測產(chǎn)物進(jìn)行測序，4條片段分別隨機(jī)測定一個(gè)反應(yīng)，以避免出現(xiàn)假陽性。1.2.9 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上90 V電泳45 min，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因大豆的水分含量

按1.2.1的GB／T 5497—1985測得的轉(zhuǎn)基因大豆的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.06%。

2.2 微波處理抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆DNA的質(zhì)量濃度

微波處理的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆基因組質(zhì)量濃度的測定結(jié)果如表5所示。

表5 經(jīng)微波處理的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的基因組質(zhì)量濃度

由表5可見，未加工轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆DNA的質(zhì)量濃度約為94 ng／μL，在微波處理的條件下，隨著處理時(shí)間的增加，提取的DNA質(zhì)量濃度逐漸降低。當(dāng)微波處理3 min時(shí)，提取的基因組質(zhì)量濃度驟然降低，當(dāng)微波處理5 min時(shí)，其質(zhì)量濃度無法檢測，幾乎為零。A260／A280接近 1.8，A260／A230接近2.5，說明提取的基因組純度較高，沒有蛋白、碳水化合物等雜質(zhì)的污染。

2.3 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆微波處理后外源基因CP4-EPSPS的降解變化

微波處理后轉(zhuǎn)基因大豆基因的電泳圖見圖1。大豆外源基因CP4-EPSPS的PCR檢測結(jié)果見圖2。檢測中，以未經(jīng)處理的轉(zhuǎn)基因大豆的外源基因的檢測結(jié)果作為陽性對照，檢測了抗草甘膦CP4-EPSPS目的基因的4條梯度片段。

圖1 微波處理的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆基因電泳圖

在微波處理過程中，對應(yīng)處理時(shí)間1、2、3、4、5 min，樣品吸收的能量分別為 48、96、144、192、240 kJ。結(jié)合表2、圖1和圖2進(jìn)行分析可知，隨著微波處理時(shí)間的增加，樣品中DNA質(zhì)量濃度急劇下降，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到3 min時(shí)，其DNA質(zhì)量濃度僅有9 ng／μL左右；由PCR檢測結(jié)果可以看出，微波處理1～2 min后，還可以檢測出4個(gè)條帶（圖2 a～圖2d），表明，外源基因尚未被充分降解。當(dāng)微波處理時(shí)間超過3 min之后，已檢測不到≥100 bp的外源DNA片段（圖2 a～圖2d）。表明，外源基因已經(jīng)被充分降解。100 bp以下的外源DNA片段已無原有的基因活性。

圖2 微波處理抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆外源基因CP4-EPSPS的PCR檢測

2.4 超高壓處理抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆DNA的質(zhì)量濃度

超高壓處理的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆基因組質(zhì)量濃度的測定結(jié)果如表6所示。

表6 超高壓處理抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆基因組質(zhì)量濃度

由表6可見，A260／A280接近1.8，A260／A230接近2.5，說明提取的基因組純度較高，沒有污染。與未處理的轉(zhuǎn)基因大豆的基因組質(zhì)量濃度相比，隨著壓力的增強(qiáng)，超高壓處理大豆粉的DNA質(zhì)量濃度降低，但當(dāng)壓力達(dá)到500 MPa時(shí)，轉(zhuǎn)基因大豆提取的基因組的質(zhì)量濃度仍有約40 ng／μL，是未處理大豆所提取的基因組質(zhì)量濃度的1／2左右，表明超高壓處理對大豆基因組的降解或破壞作用遠(yuǎn)低于微波處理的作用。

2.5 超高壓加工對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因CP4-EPSPS的降解作用

本研究檢測了抗草甘膦CP4-EPSPS目的基因4條梯度片段，在檢測的過程中，以未處理轉(zhuǎn)基因大豆外源基因?yàn)槟０錎NA進(jìn)行檢測的結(jié)果作為陽性對照，確保試驗(yàn)操作和體系正常，雙蒸水空白對照無檢測產(chǎn)物出現(xiàn)，說明PCR操作過程無污染。

圖3 超高壓處理后的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆基因組電泳圖

從電泳結(jié)果可以看出，以未經(jīng)超高壓處理的樣品DNA作為模板，對CP4-EPSPS基因不同長度片段進(jìn)行檢測，各處理樣品均可檢測出4條不同長度片段的條帶，說明即使經(jīng)500 MPa的壓力處理10 min，外源基因也未完全降解 （圖4），仍能檢測出1 512、807、408、206 bp大小的片段（圖 4），僅1 512 bp片段的濃度有所降低。

圖4 經(jīng)超高壓處理的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆外源基因CP4-EPSPS的PCR檢測

3 討論

3.1 微波處理對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆外源基因的影響

抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆在2 450 MHz微波作用下，所含水分、蛋白質(zhì)等電解質(zhì)分子隨電場的變化發(fā)生高速振動(dòng)，造成分子間的碰撞和劇烈摩擦，從而產(chǎn)生高熱，在較短的時(shí)間內(nèi)會使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得松散、降解。張海華等［15］的研究結(jié)果表明，微波在加熱功率為600、800、1 000 W加熱1 min，可削弱面筋蛋白分子間或分子內(nèi)的非共價(jià)作用，使部分二硫鍵斷裂，使面筋蛋白緊密的結(jié)構(gòu)變得松散。而當(dāng)微波處理時(shí)間加長至2 min以上時(shí)，由于水分損失，植物籽粒內(nèi)溫度迅速上升，超過100℃，可使轉(zhuǎn)基因植物外源DNA發(fā)生有效降解。Song等［16］用微波爐（800 W）處理經(jīng)煮熟、揉捏、成型、冷卻的抗除草劑轉(zhuǎn)基因大米（湘 125S／Bar 68-1）片3 min，其SPS基因（7 150 bp）僅可檢測出916、456、277、168 bp的基因片段，而Bar基因（615 bp）僅可檢出370 bp和175 bp大小的基因片段。CAMV35S啟動(dòng)子（835 bp）可檢測出735、446、195 bp的片段，對 NOS終止子（253 bp）則僅測出180 bp大小的片段。表明不同外源基因和調(diào)控原件在相同微波處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性是不同的，這與其蛋白自身結(jié)構(gòu)與特性相關(guān)。Vijayakumar等［17］研究了微波熱加工對轉(zhuǎn)基因大豆的影響。用540 W和900 W微波處理樣品2 min，GM大豆的DNA濃度從100 ng／mg分別下降到約76 ng／mg和53 ng／mg。從微波處理的GM大豆中可以檢測到101 bp的EPSPS的基因片段。本試驗(yàn)結(jié)果表明，微波加熱1 min時(shí)，DNA質(zhì)量濃度下降約1／3，說明部分GM大豆的DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生了降解。微波加熱2 min內(nèi)，GM大豆DNA濃度的下降趨勢與Vijayakumar等［17］的研究結(jié)果相同。而從提取的DNA中可以擴(kuò)增出1 512、807、408、206 bp的外源 CP4-EPSPS基因的片段。當(dāng)微波處理3 min及以上時(shí)，已檢測不到≥100 bp的外源基因片段。表明GM大豆的外源基因已經(jīng)嚴(yán)重變性降解甚至焦化。

3.2 超高壓對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆外源基因的影響

超高壓加工是在低溫、室溫和溫和加熱的條件下采用100～900 MPa壓力對食品進(jìn)行殺菌和殺滅有害微生物而很少影響食品新鮮度、質(zhì)構(gòu)、色澤風(fēng)味的物理加工方法［18］。通常認(rèn)為，在高壓作用下，形成高分子立體結(jié)構(gòu)的氫鍵、離子鍵等非共價(jià)鍵發(fā)生變化，而共價(jià)鍵不發(fā)生變化，即小分子物質(zhì)不被破壞。曾慶梅等［19］研究了超高壓參數(shù)對大腸桿菌DH5質(zhì)粒DNA的影響，結(jié)果表明，在25℃經(jīng)300、400、500 MPa壓力處理15 min后，樣品吸光度與未經(jīng)高壓處理樣品相比吸光度上升，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示大腸桿菌 DH5質(zhì)粒 DNA經(jīng)超高壓（300、400、500 MPa）處理后條帶增多，表明超高壓處理影響了質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)。而蘇丹等［14］就超高壓處理對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)影響的研究表明，400～600 MPa下處理20 min，大豆蛋白巰基含量和表面疏水性都明顯增加，大豆蛋白的亞基組成發(fā)生明顯變化，可使蛋白質(zhì)由較大的顆粒解聚成較小的顆粒。本研究結(jié)果顯示，以500 MPa壓力處理樣品10 min后，樣品的基因組質(zhì)量濃度比未處理組降低55.7%，但仍能檢出1 512、807、408、206 bp的外源基因片段，僅1 512 bp片段的濃度有明顯降低。說明超高壓處理不能有效降解抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的外源基因DNA。

4 結(jié)論

4.1 本試驗(yàn)條件下，微波處理≥3 min時(shí)，能有效降解抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的外源基因CP4-EPSPS，樣品中已經(jīng)檢測不出100 bp以上的CP4-EPSPS基因片段。

4.2 經(jīng)100～500 MPa的超高壓處理10 min，不能有效降解抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的外源基因CP4-EPSPS。

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The Effect of Microwave and Ultra-High Pressure Parameters on the Degradation of Exogenous DNA of GM Soybean

Wang Weiguo Zhu Zhanqi Wu Xingquan
（Bio-engineering College，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）

The purpose of this experiment is to study the effects of microwave and ultra-high pressure parameters on the degradation of exogenous DNA CP4-EPSPS of GM soybean.The GM soybean samples were treated for 1，2，3，4 and 5 min separately by microwave，or treated by 100，200，300，400 and 500 MPa pressure respectively for 10 min.Then the samples both treated and untreated were tested for the degradation of exogenous gene of GM soybean by qualitative PCR detection method.The results showed that Roundup Ready soybean genome concentration decreased with the increasing of microwave treating time.When the treating time reached 3 min and 5 min，the genome concentration reduced to 9 ng／μL and 0 ng／μL.PCR test results showed that exogenous gene has been degraded to smaller than 100 bp；For the ultra-high pressure treatment，the genome concentration decreased with the increase of pressure.After 500 MPa treatment，the concentration of the genome reduced to 40 ng／μL，fragments of 1 512 bp could still be detected out.Comparing with the ultra-high pressure treatment，microwave treatment was more effective to the degradation of exogenous gene of GM soybean.

GM soybean，CP4-EPSPS，microwave，ultra-high pressure，degradation

S816.9

A

1003-0174（2015）02-0020-06

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃（2011BAD26B0401）

2013-09-20

王衛(wèi)國，男，1956年出生，教授，飼料加工新技術(shù)