潘宇政 黃李平 李 凱 彭玲玲 朱翠香

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，廣西 南寧 530021）

·研究報告·

牛膝對重型顱腦損傷大鼠血清IL-2及神經(jīng)細胞凋亡的影響*

潘宇政1△黃李平1李 凱1彭玲玲1朱翠香2

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，廣西 南寧 530021）

目的觀察牛膝水提取物對重型顱腦損傷大鼠血清IL-2及神經(jīng)細胞凋亡的影響，并探討血清IL-2含量與神經(jīng)細胞凋亡關(guān)系。方法將SD大鼠隨機分成對照組、模型組、牛膝高劑量組、牛膝中劑量組和牛膝低劑量組。于傷后6 h給牛膝各用藥組灌食牛膝水提取物，其余兩組灌食等量0.9%氯化鈉注射液。每日1次，連續(xù)7 d，傷后第7日分別采集血標(biāo)本及腦組織。采用ELISA及TUNEL原位法分別檢測血清IL-2含量和損傷區(qū)神經(jīng)細胞的凋亡。結(jié)果（1）重型顱腦損傷大鼠血清IL-2含量明顯降低，牛膝水提取物可以提高重型顱腦損傷大鼠血清IL-2含量，這一作用與劑量呈正相關(guān)關(guān)系。（2）重型顱腦損傷大鼠存在明顯的神經(jīng)細胞凋亡，用牛膝水提取物干預(yù)后不能改善神經(jīng)細胞凋亡，高劑量反而加重腦組織的細胞凋亡。這一作用與血清IL-2含量升高相關(guān)。結(jié)論牛膝水提取物能提高重型顱腦損傷大鼠血清IL-2的含量，血清IL-2含量升高會加重重型顱腦損傷大鼠腦細胞的凋亡。

牛膝 顱腦損傷 IL-2 神經(jīng)細胞凋亡

研究表明重型顱腦損傷存在免疫抑制和細胞凋亡等繼發(fā)損害［1-3］，這些損害直接影響疾病的進程與預(yù)后。改善免疫抑制和細胞凋亡狀況對治療重型顱腦損傷具有重要作用。中藥牛膝 （Achyranthes bidentataBlume）為筧科植物牛膝的根，中醫(yī)認為其具有補肝腎、強筋骨、活血祛瘀等功效，臨床常用于治療腎虛、骨病、外傷等疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明，其水提取物可以增強機體免疫功能［4］，而從其中提取出一種神經(jīng)再生素（NRF）能促進神經(jīng)細胞再生［5］。牛膝的這一藥理作用和中醫(yī)藥用經(jīng)驗提示牛膝可能可以改善重型顱腦損傷存在的免疫抑制和細胞凋亡狀況。為此筆者觀察了牛膝對重型顱腦損傷大鼠血清IL-2及神經(jīng)細胞凋亡的影響，并探討IL-2與神經(jīng)細胞凋亡之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級雌雄不限SD大鼠78只，體質(zhì)量210～250 g。購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SYKG（桂）2003-0005。

1.2 主要藥品及試劑 牛膝購于廣西醫(yī)科大學(xué)一附院中藥房，原產(chǎn)地為河南省焦作市，經(jīng)鑒定規(guī)格為8～14根/500 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理實驗室制備成水提取物，生藥含量濃度為1 g/mL；大鼠IL-2R ELISA檢測試劑盒購自煙臺賽爾斯生物技術(shù)有限公司，批號SER003-96T和SER004-96T。

1.3 主要儀器 改良的Feeney′s自由落體打擊裝置，酶標(biāo)儀上海原熱電公司生產(chǎn) （型號354），SIGMA臺式高速冷凍離心機德國SIGMA生產(chǎn)（型號3k-15），顯微鏡日本OLYMPUS生產(chǎn)（型號CX21），石蠟切片機德國Leica公司生產(chǎn)（型號RM2235）。病理圖像分析儀德國leica公司生產(chǎn) （型號DMR+Q550），ipp6.0圖像分析系統(tǒng)美國Media Cybernetics公司生產(chǎn)。

1.4 動物分組及給藥 大鼠隨機分為A、B、C、D、E 5組。A為對照組，B為模型非用藥組，C為牛膝高劑量組，D為牛膝中劑量組，E為牛膝低劑量組，每組各13只大鼠。造模6 h后開始給藥：A和B按10 mL/kg給0.9%氯化鈉注射液灌胃；牛膝取臨床常用量范圍［6］的中等量20 g為每日的中等量，按低劑量為中等劑量的0.65倍，中劑量為高劑量的0.65倍計算用量，經(jīng)人與大鼠用藥量等量換算后，大鼠的 C、D、E分別以3.2，2.1，1.4 g/kg灌胃；每日1次，共7次。

1.5 重型顱腦損傷模型和對照組大鼠的制備 改良的Feeney′s自由落體方法［7］制作大鼠重型顱腦損傷模型。大鼠經(jīng)稱重，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，麻醉成功后，將動物俯臥位，頭部固定于手術(shù)臺上。剪去大鼠頭頂部毛發(fā)，消毒后于矢狀正中切開頭皮，剝離骨膜，暴露左側(cè)頂骨，在冠狀縫后1.5 mm，中線旁左側(cè)2.5 mm處，用牙科鉆鉆1個小孔，并擴大為直徑5 mm的骨窗，保持硬腦膜完整；將一圓形鋼板墊（直徑約4.5 mm，厚度3.5 mm）置于硬膜外，用50 g擊錘從20 cm高處沿套管呈自由落體沖擊于致傷墊，造成頂葉局部性腦挫裂傷，打擊后，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。對照組大鼠僅切開頭皮，保持顱骨完整，然后縫合頭皮。至傷動物蘇醒后灌胃原籠喂養(yǎng)。致傷動物蘇醒后原籠喂養(yǎng)。

1.6 神經(jīng)功能缺損評分 參照有關(guān)文獻［8］對各組動物進行神經(jīng)功能缺損評分，其評分標(biāo)準(zhǔn)參照《現(xiàn)代藥理實驗方法學(xué)》［9］評分方法，采用10分制，單盲法進行評分。造模后6 h評分＞2分則表明模型成功，＜2分則從本研究中剔除。

1.7 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測方法 最后一次給藥后6 h處死。（1）心臟采血1.5mL，4℃，3000r/min離心10min，取上清液，置-80℃冰箱待測IL-2。參照IL-2試劑盒說明書，用354型全自動酶標(biāo)儀檢測。（2）經(jīng)升主動脈灌注0.9%氯化鈉注射液200 mL，直至右心房流出液清亮為止，再以4%多聚甲醛液200 mL灌注，斷頭取腦迅速浸入4%多聚甲醛液中固定24 h，修成4 mm塊，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，行5 μm冠狀切片，脫蠟至水備用，以TUNEL原位法檢測損傷區(qū)凋亡細胞，按試劑盒說明步驟進行檢測，在光學(xué)顯微鏡下觀察TUNEL免疫反應(yīng)的結(jié)果，并以ipp6.0圖像分析軟件計算陽性細胞光密度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間采用單因素方差分析（One-Way-ANOVA）進行比較。若方差不齊，則采用秩和檢驗，進行秩次轉(zhuǎn)換后的方差分析。非雙變量正態(tài)分布資料的相關(guān)分析，選擇Pearson相關(guān)系數(shù)。檢驗水準(zhǔn)：取α=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評分值比較 見表1。B組與C、D、E組相比較，神經(jīng)功能缺損評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。造模后6 h，B、C、D、E組的神經(jīng)功能缺損評分均＞2分，表明造模成功。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分值比較（分，±s）

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分值比較（分，±s）

組別 n A組 1 3 B組 1 3 C組 1 3神經(jīng)功能缺損評分值0 . 3 8 ± 0 . 5 1 7 . 4 6 ± 0 . 7 8 7 . 3 1 ± 0 . 8 5 D組 1 3 7 . 0 8 ± 0 . 7 6 E組 1 3 7 . 1 5 ± 0 . 6 9

2.2 各組血清IL-2含量比較 見表2。B組血清IL-2含量明顯低于A組，D組、E組血清IL-2含量則沒有下降，明顯高于B組。C組與B組一樣明顯低于A組與D、E組。結(jié)果提示，重型顱腦損傷大鼠受傷后血清IL-2含量明顯下降。牛膝水提取物可以對抗重型顱腦損傷出現(xiàn)的血清IL-2含量下降。這一對抗作用與劑量有關(guān)，低劑量沒有作用，中劑量以上才能發(fā)揮作用。而且呈現(xiàn)隨著劑量增加而增強趨勢。

2.3 各組腦組織TUNEL凋亡細胞測定值比較 見表3，圖1。B組及各用藥組與A組比較，光密度（IOD）明顯升高。各用藥組與B組相比，C組光密度（IOD）明顯高于B組，亦高于D、E兩組。D、E兩組與B組無差別，D、E兩組之間亦無差異（P＞0.05）。結(jié)果表明重型顱腦損傷大鼠受傷后腦組織出現(xiàn)明顯的細胞凋亡。牛膝水提取物沒有改善重型顱腦損傷大鼠腦細胞的凋亡，在高劑量時反而加重細胞凋亡。

表2 各組血清IL-2含量比較（pg/mL，±s）

表2 各組血清IL-2含量比較（pg/mL，±s）

與A組比較，*P＜0.01；與C組比較，*P＜0.01；與D組比較，△P＜0.05。

組別 n A組 1 3 B組 1 3 C組 1 3 I L -2 2 7 9 . 8 2 ± 4 0 . 7 3 1 8 9 . 8 1 ± 2 9 . 6 7*△2 7 7 . 2 2 ± 5 3 . 9 5 D組 1 3 2 4 7 . 0 7 ± 4 1 . 5 8 E組 1 3 1 9 2 . 0 8 ± 6 8 . 2 2*△

表3 各組顱腦損傷后凋亡細胞測定值比較（±s）

表3 各組顱腦損傷后凋亡細胞測定值比較（±s）

與A組比較，△P＜0.05；與C組比較，*P＜0.05。

組別 n A組 1 3 B組 1 3 C組 1 3 I O D 1 4 . 0 7 ± 7 . 8 2 2 7 . 3 9 ± 1 2 . 7 8*△4 4 . 6 9 ± 2 4 . 5 9△D組 1 3 3 6 . 6 5 ± 2 0 . 9 5*△E組 1 3 2 6 . 7 5 ± 1 1 . 6 8*△

圖1 各組大鼠腦損傷后7 d鏡下觀察損傷區(qū)周邊額皮質(zhì)細胞凋亡情況（×400）

2.4 血清IL-2水平與神經(jīng)細胞凋亡之間的關(guān)系 用雙變量相關(guān)分析法，分別檢測血清IL-2水平與神經(jīng)細胞凋亡的相關(guān)關(guān)系。（1）C組血清IL-2水平與光密度（IOD）相關(guān)關(guān)系Pearson的系數(shù)r=0.620，P=0.024（雙側(cè)），見圖2。（2）D組血清IL-2水平與光密度（IOD）相關(guān)關(guān)系Pearson的系數(shù)r=0.602，P=0.03（雙側(cè)），見圖3。（3）其他各組血清IL-2水平與神經(jīng)細胞凋亡無相關(guān)關(guān)系。結(jié)果顯示C、D組血清IL-2水平與神經(jīng)細胞凋亡的數(shù)量有正相關(guān)關(guān)系。

圖2

圖3

3 討 論

3.1 牛膝對重型顱腦損傷血清IL-2水平的影響IL-2主要由輔助性T淋巴細胞產(chǎn)生，可以促進T細胞增殖和分化，促進B細胞增殖和分泌抗體，增強NK的殺傷活性，激活單核-吞噬細胞，還能促進多種淋巴因子表達，其水平的高低能反映機體免疫功能狀況。本研究顯示，B組血清IL-2水平較A組明顯降低，說明重型顱腦損傷大鼠早期免疫功能處于抑制狀態(tài)。這與我們既往相關(guān)研究結(jié)果和其他文獻報道基本一致［10-11］。牛膝藥用歷史悠久，神農(nóng)本草經(jīng)已有記載，具有補益肝腎、活血化瘀等功效，常用于肝腎不足、跌打損傷等病的治療?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)牛膝具有改善機體免疫功能作用。本研究觀察到牛膝可以提高重型顱腦損傷大鼠血清IL-2水平。這一作用與劑量呈正相關(guān)關(guān)系，低劑量作用不明顯，中劑量才發(fā)揮顯著作用，并且呈現(xiàn)隨著劑量增加而加強的趨勢。

3.2 牛膝對重型顱腦損傷神經(jīng)細胞凋亡的影響及與血清IL-2水平的關(guān)系 重型顱腦損傷對腦組織造成的損害，傳統(tǒng)觀點曾認為細胞壞死是細胞死亡的唯一途徑。1995年Rink［12］在大鼠液壓沖擊腦損模型上在電鏡下首次觀察到細胞凋亡。隨后不斷有許多學(xué)者也證明了大腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞凋亡現(xiàn)象［13-14］。并且發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷的動物模型中不僅神經(jīng)元可出現(xiàn)凋亡，星形膠質(zhì)細胞、少數(shù)膠質(zhì)細胞等膠質(zhì)細胞等也可出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象［15］。腦損傷后存在腦細胞凋亡已基本達成共識，但凋亡的程度在傷后的不同時間會有所差別。本研究觀察到重型顱腦損傷大鼠受傷7 d后腦組織存在明顯的神經(jīng)細胞凋亡。曾有報道，從牛膝提取出的一種神經(jīng)再生素（NRF）能促進神經(jīng)細胞再生［4］。實驗中當(dāng)用牛膝水提取物干預(yù)后，重型顱腦損傷大鼠神經(jīng)細胞凋亡并沒有得到改善，在高劑量時反而加重神經(jīng)細胞的凋亡。牛膝這一加重神經(jīng)細胞凋亡的現(xiàn)象，考慮與其提高血清IL-2水平有關(guān)。用雙變量相關(guān)分析法分析重型顱腦損傷大鼠神經(jīng)細胞凋亡與血清IL-2之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)C、D組血清IL-2水平與神經(jīng)細胞凋亡的數(shù)量有正相關(guān)關(guān)系。表明血清IL-2含量升高可以加劇神經(jīng)細胞凋亡。

血清IL-2含量升高導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡的機制，主要與機體免疫功能增強有關(guān)。李衛(wèi)等［16-17］認為顱腦損傷后，腦組織損傷灶局部CD4+、CD8+T細胞免疫應(yīng)答顯著增強，其中CD8+T細胞可介導(dǎo)靶細胞凋亡，加重腦組織的繼發(fā)性損傷。同時腦組織急性損傷后，平時由于血腦屏障的阻隔，腦組織與免疫系統(tǒng)相對隔離而形成的隱蔽性抗原大量釋放，可能刺激機體產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)。其在臨床研究也發(fā)現(xiàn)，患者腦脊液的免疫球蛋白（Ig）含量與早期的Lasgow評分及恢復(fù)期的殘疾評分密切相關(guān)，提示體液免疫反應(yīng)加重繼發(fā)性腦損傷［18］。而一些研究則發(fā)現(xiàn)應(yīng)用免疫抑制劑對腦組織損傷具有保護作用［11］。這些研究結(jié)果提示免疫反應(yīng)在一定條件下會加重重型顱腦損傷的腦組織損傷。

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The Effect of Achyranthes Bidentata on Serum IL-2 and Neuronal Apoptosis in Severe Traumatic Brain Injury Rats

PAN Yuzheng，HUANG Liping，LI Kai，et al. The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical U-niversity，Guangxi，Nanning 530021，China

Objective：To observe the effects of water extract from Achyranthes bidentata on serum IL-2 and neuronal apoptosis in a rat model with severe traumatic brain injury and to discuss the correlationship of serum IL-2 and neuronal apoptosis.Methods：SD rats were randomly divided into sham-operated group，model group，achyranthes bidentata high dose group，achyranthes bidentata middle dose group and achyranthes bidentata low dose group.6 hours after injury，the three treatment groups were force-fed with achyranthes bidentata water extract，and the rest of other two groups were force-fed with amount of saline solution，once per day for 7 days.7 days after injury，blood and brain tissue samples were collected.Serum IL-2 and apoptosis of damaged neuronal area were detected by ELISA and TUNEL respectively.Results：Serum IL-2 decreased obviously in severe traumatic brain injury rats.Achyranthes bidentata water extract could increase the content of serum IL-2 in severe traumatic brain injury rats and this effect was positively related to dose.Obvious neuronal apoptosis exists in severe traumatic brain injury rats.The intervention of achyranthes bidentata water extract did not improve the nerve cell apoptosis.On the contrary，High-dose achyranthes bidentata aggravated neuronal apoptosis，and this effect was related to the increased serum IL-2.Conclusion：Achyranthes bidentata water extract can increase the serum IL-2 levels of severe traumatic brain injury rats，and the increase of serum IL-2 can aggravate neuronal apoptosis.

Achyranthes bidentata；Traumatic brain injury；IL-2；Neuronal apoptosis

R285.5

A

1004-745X（2015）02-0197-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.02.004

2014-10-18）

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳重點科研課題（No.200847）

△通信作者（電子郵箱：pyz79298@sina.com）