趙偉鵬 李 波 黃金昶

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029）

·研究報告·

加味烏梅丸誘導胰腺癌sw1990細胞NOD-SCID小鼠移植瘤細胞凋亡的實驗研究*

趙偉鵬1李 波1黃金昶2△

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029）

目的觀察加味烏梅丸在體內(nèi)誘導移植性人胰腺癌細胞凋亡的作用。方法將20只荷瘤小鼠分為對照組、用藥組各10只。NOD/SCID小鼠皮下移植瘤造模成功后，用藥組每日灌胃加味烏梅丸生藥0.4 g/0.4 mL，對照組每日給予無菌注射用水0.4 mL。給藥期間每5日測量并計算皮下移植瘤體積，繪制移植瘤生長曲線。20 d后處死小鼠，稱取瘤質(zhì)量，流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡率，TUNEL染色標記細胞凋亡，觀察細胞形態(tài)學改變。結(jié)果用藥組移植瘤的體積的增長幅度明顯小于對照組（P＜0.05）。加味烏梅丸對NOD/SCID小鼠移植性人胰腺癌瘤抑瘤率為22%，流式細胞分析用藥組的早期凋亡率為（29.6833±0.76）%，與對照組（17.0167± 2.75）%相比，明顯提高（P＜0.01），TUNEL法檢測用藥組腫瘤細胞凋亡指數(shù)（A1）為（59.4±19.3）%，與對照組的（19.2±7.4）%比較明顯提高（P＜0.01）。結(jié)論加味烏梅丸可以通過促進腫瘤細胞的凋亡而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。

烏梅丸 胰腺癌 細胞凋亡

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，近年來發(fā)病率和死亡率明顯上升。5年生存率＜1%，是預后最差的惡性腫瘤之一。2010年美國一項調(diào)查研究顯示胰腺癌已是癌癥發(fā)病率第10位，死因第4位［1］，2006年發(fā)病率與死亡率均為第6位［2］。2012年最新數(shù)據(jù)表明，胰腺癌已是上海第5大腫瘤死因。其確診時多屬晚期，大多失去手術(shù)機會，而常規(guī)放化療療效欠佳。黃金昶教授及其研究團隊運用加味烏梅丸治療胰腺癌近20年，效果理想。通過誘導腫瘤細胞凋亡進而抑制腫瘤是中醫(yī)藥治療腫瘤的一個非常重要的途徑。本研究旨在探討在動物體內(nèi)加味烏梅丸對荷瘤裸鼠胰腺癌細胞凋亡的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級NOD/SCID小鼠，雄性，3～4周齡，體質(zhì)量（20±2）g，共20只，購自維通利華。購回后在中日友好醫(yī)院臨床研究所SPF級動物室普食飼養(yǎng)。

1.2 實驗材料 細胞株sw1990購自中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤細胞庫，復蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。加味烏梅丸藥物組成：烏梅50 g，當歸20 g，細辛3 g，川椒6 g，桂枝10 g，黃連3 g，黃柏10 g，黨參10 g，干姜10 g，制附片10 g，白芍30 g，生黃芪30 g，壁虎30 g，炒枳殼10 g，木香10 g等。中藥飲品購自北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)中心，由中日友好醫(yī)院藥學部制備，常規(guī)水煎，水浴濃縮至生藥含量為4.0 g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩UNEL熒光標記試劑盒購自美國羅氏公司。流式細胞儀：BD FACSCantoⅡ。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司。

1.3 造模與分組 NOD/SCID小鼠移植瘤模型建立：人胰腺癌sw1990細胞株在含10%小牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)擴增，取對數(shù)生長期的5×107/mL細胞制成單細胞懸液，取0.1 mL接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，在SPF環(huán)境飼養(yǎng)下觀察。成瘤率=瘤體積直徑大于5 mm的小鼠數(shù)/該實驗組的小鼠數(shù)×100%。等到小鼠移植瘤皮下可觸及，腫瘤直徑長到0.5 cm時，將荷瘤鼠隨機分成對照組和用藥組各10只。分組后用藥組每日灌胃生藥0.4 g/0.4 mL。對照組每日給予無菌注射用水0.4 mL。

1.4 實驗方法 （1）瘤徑測量。分組后，每5日測量瘤徑1次，利用游標卡尺測量其最長徑及其垂直徑，計算腫瘤體積，公式為V=1/2ab2，繪制腫瘤生長曲線圖。（2）瘤質(zhì)量測量。給藥20 d后處死小鼠，剝離瘤體，測量瘤塊質(zhì)量，計算抑瘤率。抑瘤率=（對照組瘤質(zhì)量-治療組瘤質(zhì)量）/對照組瘤質(zhì)量×100%。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 （1）取材將腫瘤組織置入RPMI1640培養(yǎng)液中，反復漂洗，沖凈，剪成1～2 mm3小塊，研磨，400目尼龍膜過濾，離心去上清，用10%小牛血清的PBS懸浮，移入EP管，加無水乙醇，離心細胞棄上清，PBS重懸細胞，再離心1次棄上清。（2）用預冷的1 mL PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)（細胞數(shù)量不少于105），1000 g，4℃離心5 min。收集細胞。（3）加入400 μL 1×Binding Buffer輕輕重懸細胞。（4）加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。（5）加入10 μL PI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置5 min。（6）在30 min內(nèi)進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.6 TUNEL染色 （1）用二甲苯浸洗2次，每次5 min。（2）用梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）各浸洗1次，每次3 min。（3）用Proteinase K工作液處理組織15～30 min在37℃8 min；（4）PBS漂洗2次。（5）制備TUNEL反應混合液，處理組用50 μL TdT+450 μL標記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50 μL標記的dUTP液，陽性對照組先加入100 μL DNase 1，反應在15～25℃×10 min，后面步驟同處理組。（6）玻片干后，加50 μL TUNEL反應混合液 （陰性對照組僅加50 μL標記的dUTP液）于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×1 h。（7）PBS漂洗3次。（8）玻片干后加50 μL converter-POD于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×30 min。（9）PBS漂洗3次。（10）在組織處加50～100 μL DAB底物，反應15～25℃× 10 min。（11）PBS漂洗3次。（12）拍照后再用蘇木素復染，分化，自來水返藍。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.7 采集圖象及圖像分析 著色表達于細胞胞核，鏡下（×100）下拍攝3個視野，將采集的圖像應用Imagepro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)進行分析，判斷標準［3］分布，胞核或胞核和胞質(zhì)同時呈棕黃色，呈典型凋亡形態(tài)特征。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。采用t檢驗比較各指標差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 移植瘤造模成功 于NOD/SCID小鼠右側(cè)腋窩皮下注射sw1990細胞后約1周，可觸及皮下移植瘤形成，成瘤率100%。

2.2 腫瘤生長曲線 待瘤結(jié)節(jié)形成后，測量并計算瘤體積，繪制生長曲線圖，移植瘤的生長曲線（圖1）表明，對照組及用藥組移植瘤的體積隨著時間的延長而明顯增加，但用藥組移植瘤的體積的增長幅度明顯小于對照組（P＜0.05）。

圖1 移植瘤生長曲線圖

2.3 瘤質(zhì)量測量及抑瘤率 灌胃給藥20 d后，麻醉脫頸處死小鼠，取下移植瘤，剔除局部壞死組織，用分析天平進行稱重。兩組移植瘤質(zhì)量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與移植瘤體積相一致，計算抑瘤率為22%。

組 別 樣本數(shù) 瘤質(zhì)量（g） 抑瘤率（%）對照組 1 0 0 . 9 7 ± 0 . 1 4 3用藥組 1 0 0 . 7 6 ± 0 . 1 8 3 2 2 %

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果 用藥組與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與瘤質(zhì)量結(jié)果相一致。

組 別 樣本數(shù) 各組早期凋亡率（%）對照組 1 0 1 7 . 0 1 6 7 ± 2 . 7 4 6 9 4用藥組 1 0 2 9 . 6 8 3 3 ± 0 . 7 6 2 6 7

2.5 TUNEL檢測細胞凋亡 用藥組與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01），與瘤質(zhì)量結(jié)果相一致。見圖2，圖3。

組 別 樣本數(shù) 各組凋亡指數(shù)（%）對照組 1 0 1 9．2 ± 7 . 4用藥組 1 0 5 9 . 4 ± 1 9 . 3

圖1 對照組TUNEL染色圖片示凋亡細胞較少（×100）

圖2 用藥組見較多核染色呈深淺不一棕褐色的凋亡細胞（×100）

3 討 論

加味烏梅丸為黃金昶教授治療胰腺癌的常用方，臨床觀察發(fā)現(xiàn)服藥后能很快改善患者的臨床癥狀，尤其對患者的疼痛、食欲下降改善較明顯，使不能行放、化療的胰腺癌患者臨床獲益，生存期得到延長［4］，對本病中醫(yī)可以從厥陰病論治，因厥陰病的提綱證和胰腺癌的常見癥狀極其相符?！秱摗け尕赎幉∶}證并治》提綱為“厥陰之為病，消渴，氣上撞心，心中疼熱，饑而不欲食，食則吐蚘。下之利不止”。而胰腺癌患者的常見癥狀則為上腹痛、上腹飽脹不適、食欲差、消瘦、乏力、腹瀉或便秘，其中上腹飽脹不適、腹痛、食欲下降均符合厥陰病的臨床表現(xiàn)。故在清上溫下烏梅丸的基礎上加用白芍，與當歸合用補肝體，助肝用，且引藥入肝經(jīng)，加用生黃芪補一身之氣，加用枳殼、木香理氣止腹痛，加用壁虎祛風、軟堅散結(jié)，且現(xiàn)代藥理研究證實壁虎對多系統(tǒng)腫瘤均有明顯的抑制作用［5］。

誘導腫瘤細胞凋亡是許多抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的重要機制。1992年英國科學家Hickman JA［6］誘導腫瘤細胞凋亡可作為腫瘤治療研究中的主要目標和手段，不但許多化療藥物通過誘導腫瘤細胞凋亡而抑制腫瘤，許多中藥提取物復方也可提高腫瘤細胞凋亡率［7-8］。本研究在臨床實踐基礎上，從動物實驗及細胞水平證實加味烏梅丸可通過誘導腫瘤細胞凋亡抑制胰腺癌。腫瘤生長曲線及瘤重測量表明加味烏梅丸可抑制胰腺癌腫瘤生長，用藥組移植瘤的體積的增長幅度明顯小于對照組，瘤重測量顯示，用藥組瘤重明顯小于對照組，抑瘤率為22%。流式細胞結(jié)果顯示，用藥組與對照組早期凋亡率有顯著差異，用藥組明顯高于對照組，這與腫瘤生長曲線及瘤重測量結(jié)果相一致。早期凋亡啟動了凋亡機制（包括線粒體膜電勢的降低，細胞色素C進入胞漿，細胞內(nèi)鈣離子濃度上升等等現(xiàn)象），相對于晚期凋亡，它更有說服力。細胞凋亡起動之初，細胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）由質(zhì)膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，可與Annexin-V熒光素標記物特異結(jié)合，并通過流式細胞檢測分析識別早期凋亡細胞。而細胞壞死時也會發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻，故合并使用鑒定細胞死活的核酸染料PI，即Annexin V-FITC/PI雙染，借以區(qū)別凋亡細胞與死亡細胞。而TUNEL法可以檢測各期的凋亡細胞，特異性和敏感性較高，且結(jié)合凋亡細胞的形態(tài)學特征加以判別，本實驗中用藥組凋亡指數(shù)明顯高于對照組且出現(xiàn)大量典型的凋亡小體，排除了壞死灶，其結(jié)果與流式細胞學結(jié)果相符，進一步證實了加味烏梅丸通過誘導細胞凋亡而抑制腫瘤。

本研究僅從細胞學角度證實加味烏梅丸通過誘導細胞凋亡而抑制胰腺癌。誘導腫瘤細胞凋亡的機制有許多種，例如阻滯腫瘤細胞的增殖周期，影響細胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導途徑，調(diào)控癌基因和抑癌基因的表達，而尋找與加味烏梅丸誘導胰腺癌細胞凋亡的相關的調(diào)控基因?qū)⑹俏覀兿乱徊降难芯恐攸c。

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Apoptosis Induced by Wumei Pill in Pancreatic Cancer Cell sw1990 in NOD/SCID Mice

ZHAO Weipeng，LIBo，HUANG Jinchang.Beijing University of TCM，Beijing 100029，China

Objective:To study the effect of Wumei pill on the apoptosis of xenografts of human pancreatic cancer cell sw1990 in NOD/SCID mice.Method:20 tumor-bearing mice were randomly divided into control group and Wumei pill group.After the murine model of human pancreatic carcinoma was established，mice in two groups received either Wumei pill decoction 0.4 g/0.4 mL/d or sterile water 0.4 mL/d for 20 days.Measurement and calculation of tumor volume in mice performed every 5 days during the 20 days.At the same time，the tumor growth curve was drawn.After treatment of 20 days，the mice were executed.The weight of tumor was evaluated. The apoptotic rates were examined by FCM and given TUNEL labeling.Morphological changes were observed by microscopy.Results:The increase of xenograft tumor volume in Wumei pill group was less than that in control group.Compared with the control group，tumor growth was significantly inhibited by Wumei pill（22%）.Apoptotic index（A1）were significantly higher（29.6833±0.76）%determined by FACScan and（59.4 19.3）%by TUNEL in Wumei pill treatment group than those in the control group［FACScan（17.0167±2.75）%TUNEL（19.2 7.4）%］.Conclusions:Wumei pill can inhibit pancreatic cancer by inducing pancreatic tumor cell apoptosis.

Wumei Pill；Pancreatic cancer；Apoptosis

R285

A

1004-745X（2015）02-0194-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.02.003

2014-09-20）

北京市科學技術(shù)委員會重大項目（No.D131100002213004）

△通信作者（電子郵箱：zhaoweipeng1118@163.com）