（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng) 110021）

姜黃素對(duì)糖尿病大鼠血腦屏障的影響

吳曉黎，王智敏，郝穎，梁鶴繽，鄭東明，郭陽(yáng)

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng) 110021）

目的探討姜黃素對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿?。―M）大鼠血腦屏障（BBB）的作用。方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常對(duì)照組、DM組、DM+姜黃素組，3個(gè)月后檢測(cè)各組大鼠BBB通透性、BBB緊密連接蛋白claudin和occludin的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)大鼠皮層白細(xì)胞介素（IL）-10、IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的蛋白含量，Western blot法檢測(cè)各組大鼠核因子κB（NF-κB）的表達(dá)。結(jié)果姜黃素對(duì)DM大鼠的血糖沒有顯著影響，但可降低DM大鼠的體質(zhì)量。DM組大鼠BBB通透性顯著增加（P＜0.01），claudin和occludin的表達(dá)顯著降低（P＜0.01），IL-10的表達(dá)降低（P＜0.01），IL-6和TNF-α的蛋白含量明顯升高（P＜0.01），NF-κB的表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。給予姜黃素可升高claudin和occludin的表達(dá)（P＜0.05），降低BBB通透性（P＜0.05），減少IL-6和TNF-α的含量（P＜0.05），提高IL-10的含量（P＜0.05），并顯著抑制NF-κB的表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)論應(yīng)用姜黃素可通過抑制DM誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，升高claudin和occludin的表達(dá)，降低DM大鼠BBB通透性，保護(hù)DM大鼠的BBB。其保護(hù)作用可能與NF-κB通路有關(guān)。

姜黃素；糖尿病；血腦屏障；核因子κB

多年來(lái)一直認(rèn)為糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）與血管病變有關(guān)［1］。在腦部，DM導(dǎo)致的血管炎癥使血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）結(jié)構(gòu)和功能的完整性受到破壞［2，3］，這與DM腦血管病并發(fā)癥密切相關(guān)。DM對(duì)BBB的損傷，造成腦內(nèi)內(nèi)環(huán)境的紊亂，加重神經(jīng)元的損傷和死亡，增加神經(jīng)系統(tǒng)事件的風(fēng)險(xiǎn)。但是DM對(duì)BBB的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。

姜黃素是從姜黃屬植物根莖中提取出來(lái)的一種酚性色素，具有多方面的藥理作用，在基因和細(xì)胞信號(hào)通路多水平上具有抗炎等藥理學(xué)作用［4］，對(duì)動(dòng)脈硬化、DM等疾病具有良好的防治作用，已經(jīng)被醫(yī)學(xué)人員所關(guān)注。但其是否對(duì)DM的BBB有保護(hù)作用尚未見報(bào)道。我們應(yīng)用鏈脲佐菌素介導(dǎo)的DM大鼠模型，觀察姜黃素對(duì)BBB結(jié)構(gòu)和功能的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)3月齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠分為正常對(duì)照組、DM組、DM+姜黃素組。DM大鼠模型制備前大鼠禁食12 h，給予單次腹腔注射溶解于pH 4.0～4.2、濃度為0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中的鏈脲佐菌素，劑量為50 mg/kg。正常對(duì)照組注入相同劑量生理鹽水。注射后所有大鼠放入代謝籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。大鼠血糖持續(xù)超過16.7 mmol/L、尿糖試紙（+++）的大鼠被認(rèn)定為DM大鼠。4周后根據(jù)體質(zhì)量和血糖匹配的原則，將DM大鼠分為DM組和DM+姜黃素組。姜黃素用1%羧甲基纖維素配成混懸液，DM+姜黃素組每日以姜黃素100 mg/kg灌胃，另2組給以等量的羧甲基纖維素，為期8周。

1.2 主要藥品與試劑

鏈脲佐菌素（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；1%羧甲基纖維素、伊文思藍(lán)粉劑（evans blue，EB）（美國(guó)Fluka公司進(jìn)口分裝）；兔抗claudin多克隆抗體、小鼠抗ocdudin多克隆抗體（美國(guó)Zymed公司）；白細(xì)胞介素（interleukin，IL）10、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；小鼠抗大鼠GAPDH抗體、核因子κ B（nuclear factor κB，NF-κB）單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；SABC試劑盒、DAB顯色劑、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑（北京中山公司）。

1.3 BBB通透性的測(cè)定

各組大鼠在手術(shù)前2 h股靜脈注入2%的EB（2 mL/kg）。然后在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)深度麻醉，自左心室灌注生理鹽水300 mL后，斷頭取腦，按1 mL/100 mg腦組織加入甲酰胺溶液，60℃水浴抽提24 h，用分光光度計(jì)在620 nm處測(cè)光密度值。作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算腦組織EB含量（μg/g腦質(zhì)量）。純甲酰胺溶液設(shè)為空白對(duì)照。

1.4 免疫組化法檢測(cè)claudin和occludin表達(dá)變化

3個(gè)月后大鼠麻醉，開胸，用生理鹽水灌流后4%多聚甲醛灌注固定。取腦置于上述固定液中固定24 h后，再將標(biāo)本置于30%蔗糖中沉淀24 h。組織塊在恒冷切片機(jī)上切片。免疫組化操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.5 ELISA法檢測(cè)腦組織中IL-10、IL-6和TNF-α的蛋白含量

取IL-10、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒，操作步驟按照說明書進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的光密度值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

1.6 Western blot法檢測(cè)腦組織中NF-κB蛋白表達(dá)水平的變化

每組各取5只大鼠頸椎脫臼處死、斷頭、剝離并取出大腦皮質(zhì)，稱取各組標(biāo)本100 g，剪碎加入冰預(yù)冷的細(xì)胞裂解液500 μL，超聲粉碎。4℃、12 000 r/min離心0.5 h，取上清。采用酚試劑法測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印，用含5%去脂奶粉的TTBS封閉4℃1 h。一抗（1∶500），4℃過夜。洗膜，并加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000），室溫下2 h。TTBS清洗2次，每次5 min；TBS洗1次，5 min。酶顯法顯色。使用Chemi lmager 5500 V3.0軟件進(jìn)行圖像灰度掃描，F(xiàn)luor Chem 2.0分析軟件進(jìn)行分析，獲取目的條帶和內(nèi)參照GADPH的整合光密度值，以兩者的比值作為蛋白表達(dá)半定量指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以x±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析和Bonferroni檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量和血糖的比較

DM組大鼠血糖較正常對(duì)照組比較顯著升高（P＜0.01），體質(zhì)量顯著下降（P＜0.01）。DM+姜黃素組血糖較DM組比較無(wú)明顯變化（P＞0.05），體質(zhì)量較DM組明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠的血糖和體質(zhì)量的比較Tab.1 Comparison of blood glucose and weight between each group

2.2 BBB通透性的變化

采用檢測(cè)EB的滲出量評(píng)估BBB通透性的變化。與正常對(duì)照組相比，DM組EB的含量明顯升高（P＜0.05），DM+姜黃素組EB的含量較DM組顯著下降（P＜0.05）。見表1。

2.3 各組腦組織中claudin和occludin的表達(dá)情況

免疫組化法檢測(cè)各組腦組織中claudin和occludin的表達(dá)變化。如圖1所示，與正常對(duì)照組相比，DM組claudin和occludin的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。與DM組相比，DM+姜黃素組claudin和occludin的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見表2。

圖1 各組腦組織中claudin和occludin蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of claudin and occludin in brain tissues in each group

表2 各組腦組織中claudin、occludin、IL-10、IL-6、TNF-α和NF-κB含量的變化Tab.2 Changes in expression of claudin，occludin，IL-10，IL-6，TNF-α，and NF-κB in brain tissues in each group

2.4 各組腦組織中IL-10、IL-6和TNF-α的蛋白含量

DM組的IL-10的含量顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；DM+姜黃素組的IL-10含量明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.05），明顯高于DM組（P＜0.05）。與IL-10的結(jié)果相反，DM組的IL-6和TNF-α含量顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；DM+姜黃素組的IL-6和TNF-α含量明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05），但明顯低于DM組（P＜0.05）。見表2。

2.5 各組NF-κB表達(dá)水平的變化

應(yīng)用Western blot法檢測(cè)皮層中NF-κB蛋白表達(dá)，見圖2。與正常對(duì)照組相比，DM組的NF-κB顯著增加（P＜0.01）；與DM組相比，DM+姜黃素組的NF-κB顯著減少（P＜0.01），見表2。

3 討論

DM破壞BBB的機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未明確。有人認(rèn)為DM是一種伴有多種炎性因子激活為特征的自身炎性疾?。?］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)炎性反應(yīng)的過度激活可能是DM患者BBB變化的重要機(jī)制。姜黃素為姜黃的主要活性成分，近年的大量研究證明姜黃素具較強(qiáng)的抗炎及免疫調(diào)節(jié)等活性，并且無(wú)明顯的毒副作用。本研究旨在探討姜黃素對(duì)DM大鼠BBB的改善作用及相關(guān)機(jī)制。

圖2 各組腦組織中NF-κB的表達(dá)Fig.2 Expression of NF-κB in brain tissues in each group

本研究通過建立鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DM大鼠模型并給予姜黃素，觀察姜黃素對(duì)DM大鼠血糖、體質(zhì)量的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)DM大鼠的血糖無(wú)明顯影響，但可阻止DM大鼠體質(zhì)量下降。這與Babu等［6］研究結(jié)果相似。

我們通過測(cè)定腦組織中EB含量確定各組大鼠BBB通透性的變化。結(jié)果顯示，DM組EB含量明顯升高，BBB通透性增加。免疫組化結(jié)果顯示，DM組claudin和occludin的表達(dá)顯著降低，BBB完整性受到破壞。以上結(jié)果提示DM顯著破壞了BBB的完整性，增加了BBB的通透性。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，給予姜黃素可顯著降低DM組EB的含量，BBB通透性降低，同時(shí)顯著增加DM組緊密連接蛋白claudin和occludin的表達(dá)，與DM組比較有顯著差異。與此結(jié)果相似，Jiang等［7］發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過保護(hù)局灶性腦缺血大鼠的BBB而起神經(jīng)保護(hù)作用。Sun等［8］證實(shí)姜黃素可通過降低腦出血小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶，降低BBB通透性，進(jìn)而改善神經(jīng)功能。

目前發(fā)現(xiàn)與DM相關(guān)的炎性因子很多，包括TNF-α［9］、IL-6［10］、IL-1β［11］等。大量研究表明姜黃素具有較強(qiáng)的抗炎作用，Li等［12］發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過抑制DM大鼠TNF-α從而減輕DM引起的神經(jīng)性疼痛。本研究結(jié)果顯示，DM大鼠腦組織中IL-10的含量顯著降低，IL-6和TNF-α的含量明顯升高。給予姜黃素后，IL-10的含量明顯升高，而IL-6和TNF-α含量顯著降低。以上結(jié)果表明姜黃素具有較強(qiáng)的抗炎作用。

NF-κB廣泛地參與炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)。NF-κB信號(hào)通路的失調(diào)與很多疾病有關(guān)，比如慢性炎癥、DM、自身免疫疾病等。調(diào)控NF-κB信號(hào)通路是治療炎癥、腫瘤及代謝相關(guān)疾病的重要策略。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號(hào)通路與DM微血管內(nèi)皮損傷密切相關(guān)。HO等［13］發(fā)現(xiàn)高糖激活NF-κB，并進(jìn)一步誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡。NF-κB的持續(xù)激活可能是DM微血管病變、BBB破壞的始動(dòng)機(jī)制之一。近年來(lái)研究表明，姜黃素可抑制刺激后NF-κB的活性，從而對(duì)多種疾病發(fā)揮治療與預(yù)防作用。姜黃素通過抑制NF-κB的活性而產(chǎn)生強(qiáng)大的抗炎作用［14，15］，而且姜黃素還可通過抑制NF-κB抑制蛋白α激酶和蛋白激酶B進(jìn)而抑制NF-κB的活性［16］。本研究中，Western blot結(jié)果顯示，DM大鼠NF-κB的表達(dá)顯著增加。而給予姜黃素后，NF-κB的表達(dá)顯著降低。說明姜黃素顯著抑制了DM大鼠NF-κB的激活。

綜上所述，姜黃素對(duì)DM大鼠的BBB有保護(hù)作用。姜黃素可顯著抑制DM大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)，降低BBB通透性，保護(hù)BBB結(jié)構(gòu)和功能的完整性。上述作用與其對(duì)NF-κB的抑制作用密切相關(guān)。

［1］Carrano A，Hoozemans JJ，van der Vies SM，et al.Neuroinflammation and blood-brain barrier changes in capillary amyloid angiopathy［J］.Neurodegener Dis，2012，10（1-4）：329-331.

［2］Carlsson CM.Type 2 diabetes mellitus，dyslipidemia，and Alzheimer’s disease［J］.Alzheimers Dis，2010，20（3）：711-722.

［3］Taguchi A.Vascular factors in diabetes and Alzheimer’s disease［J］.Alzheimers Dis，2009，16（4）：859-864.

［4］Banerjee M，Tripathi LM，Srivastava VM，et a1.Modulation of inflammatory mediators by ibuprofen and curcumin treatment during chronic inflammation in rat［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2003，25（2）：213-224.

［5］Snell-Bergeon JK，West NA，Mayer-Davis EJ，et a1.Inflammatory markers are increased in youth with type 1 diabetes：the SEARCH Case-Control study［J］.Clin Endocrinol Metab，2010，95（6）：2868-2876.

［6］Babu PS，Srinivasan K.Hypolipidemic action of curcumin，the active principle of turmeric（Curcuma longa）in streptozotocin induced diabetic rats［J］.Mol Cell Biochem，1997，166（1-2）：169.

［7］Jiang J，Wang W，Sun YJ，et al.Neuroprotective effect of curcumin on focal cerebral ischemic rats by preventing blood-brain barrier damage［J］.Eur J Pharmacol，2007，561（1-3）：54-62.

［8］Sun Y，Dai M，Wang Y，et al.Neuroprotection and sensorimotor functional improvement by curcumin after intracerebral hemorrhage in mice［J］.Neurotrauma，2011，28（12）：2513-2521.

［9］李昭，白英龍，姜紅堃，等.生長(zhǎng)激素釋放肽Ghrelin改善自發(fā)性糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，43（10）：902-905.

［10］Krogh-Madsen R，Plomgaard P，Keller P，et al.Insulin stimulates interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha gene expression in human subcutaneous adipose tissue［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2004，286（2）：E234-E238.

［11］Mano Y，Anzai T，Kaneko H，et al.Overexpression of human C-reactive protein exacerbates left ventricular remodeling in diabetic cardiomyopathy［J］.Circ J，2011，75（7）：1717-1727.

［12］Li Y，Zhang Y，Liu DB，et al.Curcumin sttenuates diabetic neuropathic pain by downregulating TNF-alpha in a rat model［J］.Int J Med Sci，2013，10（4）：377-381.

［13］Ho FM，Lin WW，Chen BC，et al.High glucose-induced apoptosis in human vascular endothelial cells is mediated through NF-kappaB and c-Jun NH2-terminal kinase pathway and prevented by PI3K/Akt/eNOS pathway［J］.Cell Signal，2006，18（3）：391-399.

［14］Sandur SK，Pandey MK，Sung B，et al.Curcumin，demethoxycurcumin，bisdemethoxycurcumin，tetrahydrocurcumin and turmerones differentially regulate anti-inflammatory and anti-proliferative responses through a ROS-independent mechanism［J］.Carcinogenesis，2007，28（8）：1765-1773.

［15］LoTempio MM，Veena MS，Steele HL，et al.Curcumin suppresses growth of head and neck squamous cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2005，11（19）：6994-7002.

［16］Aggarwal BB，Harikumar KB.Potential therapeutic effects of curcumin，the anti-inflammatory agent，against neurodegenerative，cardiovascular，pulmonary，metabolic，autoimmune and neoplastic diseases［J］.Int J Biochem Cell Biol，2009，41（1）：40-59.

（編輯陳姜）

Effectsof Curcumin on Blood-brain Barrier in ExperimentalStreptozotocin-induced Diabetic Rats

WUXiao-li，WANGZhi-min，HAOYing，LIANGHe-bin，ZHENG Dong-ming，GUO Yang
（DepartmentofNeurology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110021，China）

ObjectiveTo study the effect of curcumin on blood-brain barrier（BBB）in streptozotocin-induced diabetes mellitus（DM）rats.MethodsThe rats were divided into 3 groups randomly：the control group，the DM group and the DM+curcumin group.The permeability of BBB and the expressions of tight junction proteins claudin and occludin were detected after 3 months.ELISA analysis was used to detect the expression of interleukin（IL）-10，IL-6 and tumornecrosis factorα（TNF-α）levels.Western blotwas used to determine the expression ofnuclearfactorκB（NF-κB）.ResultsThe weightofDMratswas significantly reduced by curcumin，butblood glucose was notaffected.In the DMgroup，BBB permeability was significantly increased（P＜0.01）；the expression levels of claudin and occludin were significantly decreased（P＜0.01）；the expression levels of IL-6 and TNF-α were significantly up-regulated（P＜0.01）；the expression level of IL-10 was significantly reduced（P＜0.01）；and the expression level of NF-κB was significantly up-regulated（P＜0.01）.Then，administration of curcumin increased the expression of claudin and occludin（P＜0.05），reduced BBB permeability（P＜0.05），decreased the levelofIL-6 and TNF-α（P＜0.05），increased the levelof IL-10（P＜0.05），and significantly inhibited the expression of NF-κB（P＜0.01）.ConclusionCurcumin has protective effects on BBB in DM rats by inhibiting inflammatory reactions induced by DM，increasing the expression of claudin and occludin and reducing BBB permeability in DM rats.The protective mechanism may be associated with the NF-κBchannel.

curcumin；diabetes mellitus；blood-brain barrier；nuclear factor κB

R743.32

A

0258-4646（2015）04-0298-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81000467）

吳曉黎（1973-），女，講師，博士. E-mail：77kwuxiaoli@163.com

2015-01-07

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：