李 琳， 付曉佳， 楊燕燕， 韋銀鳳， 陳崇順

(南京師范大學生命科學學院，江蘇省生物多樣性與生物技術重點實驗室，江蘇 南京 210023)

洋桔梗［Eustoma grandiflorum(Raf.)Shinn.］是龍膽科草原龍膽屬觀賞植物，原產(chǎn)于北美洲［1］。經(jīng)過不斷的遺傳改良，洋桔梗以莖稈修長，花色清新，花型別致，而倍受人們喜愛，成為著名的切花和盆花花卉［2］。2009年，洋桔梗就已躋身世界切花市場的前10 位［3］。

自從洋桔梗在全世界范圍內(nèi)引種栽培以來，人們發(fā)現(xiàn)其易受多種植物病原的侵害［4］。按照病原不同，可將洋桔梗病害分為病毒性病害、細菌性病害以及真菌性病害。而在所有病害中，由真菌所引起的病害占大部分［5］。這些病害大大降低了洋桔梗的觀賞價值和商業(yè)價值。利用基因工程方法改良作物性狀可以減少育種時間，更快培育出具有商業(yè)價值的新品種，成為傳統(tǒng)育種方式的重要補充［6］。

在植物抗真菌病害基因工程育種的研究中，幾丁質酶基因是廣泛選用的目的基因。幾丁質酶(Chitinase，EC 3.2.1.14)是一種催化β-1，4糖苷鍵的水解酶，可將幾丁質降解為N-乙酰氨基葡萄糖［7］。幾丁質是由N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵連接而成的生物多聚物，是多數(shù)真菌細胞壁的組成成分［8］。因此，幾丁質酶在抵御病原真菌對植物的侵害方面具有重要作用，是植物防御系統(tǒng)的重要組成部分［9］。防治真菌病害的幾丁質酶基因工程研究，已經(jīng)在煙草、油菜、小麥等作物上取得不同程度的進展。1986年，Schlumbaum等［10］首次報道，提純的菜豆幾丁質酶具有抗真菌的活性。1991年，Broglie等［11］首次報道將菜豆幾丁質酶基因置于CaMV35S啟動子控制下，轉入煙草和油菜，轉基因植物組成型表達菜豆幾丁質酶基因，對立枯絲核菌表現(xiàn)出抗性，推遲了發(fā)病時間。劉偉華等［12］通過基因槍法將菜豆幾丁質酶基因導入小麥幼胚愈傷組織中，轉基因植株的幾丁質酶活性明顯高于對照植株，白粉病的發(fā)生時間延緩且程度較輕。王晶晶等［13］將菜豆幾丁質酶基因通過農(nóng)桿菌介導轉入南瓜中，并獲得了經(jīng)PCR檢測為陽性的轉基因植株。

本研究擬從菜豆中克隆抗真菌活性較強的Ⅰ類幾丁質酶基因，構建植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法將其轉入洋桔梗，對轉基因陽性植株進行分子鑒定、表達分析以及抑菌鑒定，以期為培育洋桔梗抗真菌新種質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

精選的架豆王菜豆(Phaseolus vulgaris)種子購于南京金盛達種子有限公司。Double Mariachi Pink洋桔梗無菌苗、大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌LBA4404、pBI121質粒由本實驗室保存。其中pBI121質粒TDNA區(qū)含有新霉素磷酸轉移酶(Neomycin phosphotransferase)基因(nptII)和報告基因β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)。PCR引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。Quick T-A Cloning Kit(含pUC57-T-vector)購于GenScript公司。植物基因組DNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒、RNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自南京華普生物公司?？敲顾?Kanamycin，Km)、利福平(Rifampicin，Rif)、羧芐青霉素(Carbenicillin，Cb)、3，5-二硝基水楊酸 DNS 等生化試劑購自南京丁貝生物公司。大豆鏈孢菌5A、5E和灰葡萄孢菌由南京農(nóng)業(yè)大學郁志芳教授惠贈。

1.2 菜豆幾丁質酶基因的克隆及植物表達載體的構建

1.2.1 菜豆幾丁質酶基因的克隆 菜豆種子發(fā)芽后取新鮮葉片100 mg，液氮研磨后使用植物基因組DNA提取試劑盒提取菜豆基因組DNA。根據(jù)NCBI GenBank上公布的菜豆Ⅰ類幾丁質酶基因序列(M13968)，設計1對特異引物，上游引物P1序列為5'-TGCTCTAGAATGAAGAAGAATAGGATGATG-3'，下游引物P2序列為5'-CGCGAATCCTCACTGAGAGGTGACAAGAAG-3'。菜豆幾丁質酶基因PCR優(yōu)化擴增體系為:10 ×PCR 緩沖液 5.0 μl，25 mmol/L MgCl23.0 μl，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μl，50 μmol/L 的引物 P1和P2各 0.2 μl，50 μg/ml菜豆基因組 DNA 5.0 μl，5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.2 μl，加 ddH2O 補至 50.0 μl。反應程序為:在95℃預變性3 min;94℃變性1 min，55℃復性1 min，72℃延伸1.5 min，循環(huán)35次，72℃延伸10 min，4℃保溫。然后用DNA膠回收試劑盒回收菜豆幾丁質酶基因PCR擴增產(chǎn)物。使用Quick T-A Cloning Kit將回收的PCR產(chǎn)物 Chi與pUC57-T-vector連接重組，得到重組子pUC57-Chi，并送至上海英駿生物技術有限公司測定目的基因的序列。然后根據(jù)NCBI上公布的菜豆幾丁質酶基因序列，進行序列的同源性分析。

1.2.2 植物表達載體的構建 利用限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I酶切pUC57-Chi和pBI121質粒，獲得菜豆幾丁質酶基因Chi和pBI121質粒的大片段。將兩者相連，構建成植物表達載體pBI121-Chi(圖1)，然后轉化大腸桿菌DH5α，進行酶切鑒定。再通過電轉化，將pBI121-Chi轉入LBA4404中，然后將轉化產(chǎn)物涂于LB+50 mg/ml Km+50 mg/ml Rif培養(yǎng)基上篩選轉化體［14］。

1.3 農(nóng)桿菌介導法轉化洋桔梗

1.3.1 葉塊預培養(yǎng)和農(nóng)桿菌侵染液的制備 參考楊燕燕等［15］的方法，選取洋桔梗無菌苗葉片，采用“五刀切”法，將葉片切成5 mm×5 mm大小均一的葉塊;將切好的葉塊置于MS+0.5 mg/L 6-BA的預培養(yǎng)基上，并與培養(yǎng)基完全接觸，于培養(yǎng)室預培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)條件:溫 度 為(25±2)℃，光 照 度 為 60 μmol/(m2·s)，光周期為16 h光照/8 h黑暗。將經(jīng)過菌落PCR檢測顯示為陽性的農(nóng)桿菌單菌落在LB+50 mg/L Km+50 mg/L Rif的平板上進行劃線，在28℃條件下，暗培養(yǎng)2 d。用接種環(huán)從平板上挑取單菌落，接種于40 ml LB+50 mg/L Km+50 mg/L Rif的液體培養(yǎng)基中，在臺式恒溫振蕩器(28℃，200 r/min)中培養(yǎng)18 h左右。取1 ml菌液接種于50 ml無抗生素的LB液體培養(yǎng)基(含100 μmol/L乙酰丁香酮)中，繼續(xù)培養(yǎng) 4～6 h后，以4 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入無菌的1/2 MS液體培養(yǎng)基直至測得的OD600值約為0.5。

圖1 pBⅠ121-Chi表達載體Fig.1 The expression vector of pBⅠ121-Chi

1.3.2 農(nóng)桿菌轉化洋桔梗葉塊 將在MS+0.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上預培養(yǎng)4 d后的葉塊置于農(nóng)桿菌侵染液中浸泡10 min。取出葉塊，用無菌濾紙吸取多余的菌液后，放回原預培養(yǎng)基中，在黑暗條件下共培養(yǎng)5 d后，進行直接卡那霉素篩選和延遲卡那霉素篩選。直接卡那霉素篩選［16］:將共培養(yǎng)后的葉塊轉入培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L 6-BA+25 mg/L Km+250 mg/L Cb)中，篩選培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計抗性不定芽數(shù)量。當抗性不定芽的高度為2～3 cm時，將其切下轉入培養(yǎng)基(MS+0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+25 mg/L Km+200 mg/L Cb)中增殖篩選，轉接篩選培養(yǎng)2次，得到抗性無根苗。延遲卡那霉素篩選:將共培養(yǎng)的葉片轉入不含Km的脫菌培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L 6-BA+250 mg/L Cb)中培養(yǎng)，待再生不定芽長至2～3 cm時，將其切下轉入MS+25 mg/L Km+200 mg/L Cb增殖篩選培養(yǎng)基中，將抗性不定芽轉接篩選培養(yǎng)2次，得到抗性無根苗。

1.3.3 抗性無根苗的生根篩選 將經(jīng)過Km篩選后長勢良好的抗性無根苗轉入1/2 MS+0.1 mg/L NAA+15 mg/L Km生根培養(yǎng)基，30 d后，篩選能夠正常生根的抗性轉化植株。

1.4 轉化植株的鑒定

1.4.1 第1次PCR檢測 取未轉化植株和能夠正常生根的抗性植株新長出的幼嫩葉片，提取基因組DNA。根據(jù)NCBI GenBank上所公布的nptII基因序列，利用軟件Primer 6.0設計1對特異性引物，對抗性轉化植株進行第1次PCR檢測，以非轉化植株為對照。上游引物P3序列為:5'-GAGAGGCTATTCGGCTATG-3';下游引物P4序列為:5'-GCTCAGAAGAACTC GTCAA-3'。PCR優(yōu)化擴增體系為:10×PCR緩沖液2.5 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μl，50 μmol/L的引物 P3和 P4各 0.5 μl，20 μg/ml基因組 DNA 2.5 μl，5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.5 μl，加ddH2O補至25.0 μl。反應程序為:在94℃預變性3 min;94℃變性30 s，58℃復性30 s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)35次，72℃延伸10 min，4℃保溫，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.4.2 第2次PCR檢測 將第1次PCR檢測為陽性的抗性株系在生根培養(yǎng)基上轉接2代，60 d后再進行第2次PCR檢測(PCR擴增體系和反應程序與第1次PCR檢測相同)，以進一步確定相關轉基因在轉化植株基因組中的整合。

1.4.3 轉化植株的RT-PCR檢測 從第2次PCR檢測為陽性的轉基因株系中，選取5個生長良好的株系進行進一步的RT-PCR，檢測nptII基因的表達。利用植物RNA提取試劑盒提取轉化株系的總RNA，按照BioTeKe SupermoⅢRT Kit的操作步驟進行RNA的反轉錄。根據(jù)nptII基因的序列，設計1對特異性引物擴增 cDNA，上游引物 P5序列為:5'-GATATGGAGCGTAGGAGTG-3'，下游引物P6序列為:5'-TCAGTAGGAGCAGGAGAC-3'。PCR優(yōu)化擴增體系為:10×PCR 緩 沖 液 2.5 μl，25 mmol/L MgCl21.0 μl，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μl，25 μmol/L 的引物 P5和 P6各1.0 μl，cDNA 模板 1.5 μl，5 U/μl Taq DNA 聚合酶0.5 μl，加 ddH2O 補至25.0 μl。反應程序為:94 ℃預變性3 min，94℃變性40 s，然后55℃復性50 s，在72℃下延伸10 min，循環(huán)35次，4℃保溫。擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.5 轉化植株的幾丁質酶活性及抗真菌性檢測

1.5.1 幾丁質酶活性的測定 幾丁質酶活性是以催化底物膠體幾丁質水解反應所產(chǎn)生的還原糖(N-乙酰氨基葡糖)的量表示的［17］。參照Saqib等［18］的方法，配制DNS試劑并制作N-乙酰氨基葡萄糖標準曲線。參照吳子健等［19］方法制備膠狀幾丁質。參考陳崇順等［20］的方法，制備轉化植株和未轉化植株葉片粗酶液，并測定幾丁質酶的活性。酶活性單位(1 U)定義為1 min水解膠體幾丁質產(chǎn)生1 μmol乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。

1.5.2 幾丁質酶抑菌活性的測定 選擇大豆鏈孢菌5A、5E和灰葡萄孢菌3種指示菌株，參照林慧珍等［21］的方法，挑取少量的菌種分別接種在PDA平板上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。第1次活化時間為7 d，待菌絲長滿培養(yǎng)皿后再按照此法進行2次活化。將活化后的菌種再培養(yǎng)5 d(28℃，黑暗)，待菌體產(chǎn)生孢子后用無菌水反復沖洗菌體，并用無菌紗布過濾，去掉菌絲后得到孢子懸浮液，以3 000 r/min離心1 min。然后用血球計數(shù)板計數(shù)，最后將得到的孢子懸浮液濃度稀釋到1 ml 2×105個。參考陳崇順等［22］的方法，進行抑菌活性的測定。吸取3種真菌的孢子懸浮液200 μl，均勻涂布于直徑為9 cm的PDA平板上，在28℃下培養(yǎng)2 d，用直徑為6 mm的無菌打孔器打孔。每孔加入200 μl粗酶液，每個株系4個重復。在28℃培養(yǎng)2 d后，測量不同粗酶液產(chǎn)生抑菌圈的直徑。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 17.0軟件，對數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 菜豆幾丁質酶基因的克隆及表達載體的構建

以提取的菜豆基因組DNA為模板，利用P1和P2引物進行PCR擴增，獲得1 000 bp左右的菜豆幾丁質酶基因(Chi)。對Chi與pUC57的重組子陽性克隆pUC57-Chi用BamH I和Xba I雙酶切檢測，得到分子量為1 000 bp和將近3 000 bp的條帶，說明Chi確已連接到載體pUC57上。根據(jù)上海英駿生物技術有限公司對重組子pUC57-Chi中Chi基因(多個克隆樣品)的測序結果，得到精選架豆王菜豆幾丁質酶基因的全序列，該序列與NCBI上公布的相關序列基本一致。表明已經(jīng)克隆到所需的目的基因。

利用限制性內(nèi)切酶 BamH I和 Xba I酶切pUC57-Chi和pBI121質粒，回收Chi和pBI121質粒的大片段，將兩者相連，得到pBI121-Chi。用BamH I和Xba I雙酶切pBI121-Chi，得到1 000 bp左右片段;而同樣用BamH I和Xba I雙酶切pBI121質粒，則沒有該片段。表明已成功構建了植物表達載體。通過電轉化法，將從大腸桿菌中提取的pBI121-Chi和pBI121質粒(對照)轉入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。

2.2 農(nóng)桿菌介導法轉化洋桔梗葉塊

將經(jīng)過4 d預培養(yǎng)、5 d共培養(yǎng)的葉塊，分別進行直接篩選(25 mg/L Km+250 mg/L Cb)和延遲篩選(25 mg/L Km+200 mg/L Cb)。直接篩選誘導不定芽時，2～3個月后不定芽才逐漸再生出來，且生長很慢，而延遲篩選誘導不定芽時，葉塊培養(yǎng)14～21 d時切口處即開始出現(xiàn)不定芽，且生長迅速(圖2)。2種篩選方法共得到76個不定芽，將其在Km選擇壓下進行初步篩選，得到42個無根抗性苗株系。無根苗通過生根培養(yǎng)基(15 mg/L Km)的篩選，得到27個能夠正常生根的株系，其中11個株系通過直接篩選獲得，16個株系通過延遲篩選獲得(圖2)。

2.3 轉化植株的鑒定

使用植物基因組DNA提取試劑盒提取抗性株系和未轉化株系的基因組DNA，并以提取的基因組為模板，利用設計的引物P3和P4進行PCR擴增，共有13個株系擴增出長度約為750 bp的nptII基因片段，其中5個株系通過直接篩選獲得，8個株系通過延遲篩選獲得。

將經(jīng)第1次PCR檢測為陽性的13個抗性株系在生根培養(yǎng)基(含15 mg/L Km)上轉接培養(yǎng)2次，60 d后進行第2次PCR檢測。結果如圖 3 所示，1、4、6、11、14、15、18、22、24、25、26號株系都擴增出了約750 bp的特異性條帶。因此，可以確認轉基因npt II已經(jīng)整合到這11個轉化株系的基因組中，其中有4個株系通過直接篩選獲得，7個株系通過延遲篩選獲得，直接篩選和延遲篩選轉基因的陽性比例分別為80.00%和87.50%。

選取長勢良好的5個轉基因株系進行RT-PCR檢測，結果如圖4所示，6、18和26號株系擴增出約200 bp的特異性條帶。該結果表明，npt II基因已經(jīng)在這3個轉化株系中正常轉錄。

圖2 葉塊不定芽的再生和抗性植株的生根篩選Fig.2 The regeneration of adventitious buds and screening of the resistant seedlings by rooting

圖3 轉接2次所得抗Km轉化株系的第2次PCR檢測Fig.3 The second PCR amplification for Km resistant lines

圖4 轉化植株的RT-PCR檢測Fig.4 RT-PCR amplification of transgenic lines

2.4 轉化植株的幾丁質酶活性及抗真菌活性

以N-乙酰氨基葡萄糖的濃度(mg/ml)為橫坐標，平均OD530值為縱坐標，繪制N-乙酰氨基葡萄糖標準曲線，得線性回歸方程為Y=0.590 x-0.037，R2=0.999 8。說明該方法在已知濃度范圍內(nèi)有良好的線性關系。用DNS法測定3個轉基因株系的幾丁質酶活性，6號株系為 (0.215±0.005)U，18號株系為(0.225±0.040)U，26號株系為 (0.286±0.002)U，未轉化株系為(0.133±0.003)U。用SPSS16.0進行單因素方差分析，結果顯示6、18和26號轉基因株系的幾丁質酶活性與未轉基因植株相比，分別提高了61.65%、69.17%和115.04%，4個株系之間的差異均達到顯著水平(P＜0.05)，在3個轉基因株系中，26號株系的幾丁質酶活性最高(0.286 U)。說明導入的外源菜豆幾丁質酶基因在洋桔梗轉化植株體內(nèi)得到了表達，但表達量在不同株系間存在差異。

提取6、18和26號轉化株系的幾丁質酶粗提液，以未轉化洋桔梗植株為對照，分別測定不同株系粗提液對大豆鐮孢菌5A、5E和灰葡萄孢菌3種指示真菌的抑制作用。以抑菌圈的直徑作為抑制作用強弱的判斷標準。結果表明，與未轉化對照相比，3個轉基因株系(6、18和26號株系)的抑菌效果顯著性增強，對大豆鐮孢菌5A的抑菌作用分別提高了66.73%、84.91%和106.00%，對大豆鐮孢菌5E的抑菌作用分別提高了30.36%、54.55%和90.91%，對灰葡萄孢菌的抑菌作用分別提高了48.71%、51.46%和71.53%，其中26號株系對3種真菌的抑菌效果最好(表1、圖5)。

表1 不同轉基因株系對指示菌株的抑菌效果Table 1 Ⅰnhibitory activities of transgenic lines against three indicator fungi

圖5 轉基因洋桔梗株系幾丁質酶粗提液對指示真菌的抑制Fig.5 Ⅰnhibition against indicator fungi by the crude chitinase extraction from three transgenic lines of Eustoma grandiflorum

3 討論

3.1 轉化體的直接篩選和延遲篩選

參考本實驗室前期工作，本研究以25 mg/L Km為選擇壓，對轉化體進行篩選。首先進行直接篩選，絕大部分的葉塊上不能分化不定芽，逐漸白化死亡，只有極少部分葉塊能夠再生，但不定芽生長很慢。Van der Krol等［23］認為可適當降低外植體分化階段的選擇壓，甚至可以除去選擇壓。賈慶利等［24］認為選擇壓施加的時機因所使用的轉化方法、外植體類型、物種等的差異而不同。如過早施加選擇壓，轉化細胞也許來不及恢復到生長狀態(tài)，抗性基因也來不及表達，轉化細胞就會在選擇壓下被抑制甚至殺死。因此，本研究進行了延遲篩選，即待不定芽長至2～3 cm后，再施加選擇壓，不定芽生長迅速、良好，能夠很快成苗。2次PCR檢測結果表明，直接篩選和延遲篩選轉基因的陽性比例相差不大，分別為80.00%和87.50%。

3.2 轉化體的2次PCR檢測

Southern blot是鑒定轉基因整合及其拷貝數(shù)的傳統(tǒng)方法，但其試驗過程較為費時、費力，同時對樣品的數(shù)量、質量及操作技術要求較高。轉基因在受體植物中，一般有2種表達:瞬時表達和穩(wěn)定表達。瞬時表達大多只延續(xù)10 d多，此后即無表達。在農(nóng)桿菌介導的轉基因研究中，脫菌培養(yǎng)一般需要5～6次繼代培養(yǎng)。如果停止使用抗生素后外植體又有農(nóng)桿菌生長，可再使用抗生素脫菌，對有的植物可一直使用抗生素，直到試管苗形成［25］。

在本研究中，我們對nptII基因運用2次操作相對簡便的PCR進行陽性植株的檢測。首先以農(nóng)桿菌轉化洋桔梗，篩選再生的不定芽，然后將繼代3次的抗性芽轉入含15 mg/L Km的生根培養(yǎng)基。30 d后，對獲得的生根抗性植株的幼嫩葉片進行第1次PCR檢測，獲得13個陽性株系，再經(jīng)2次繼代后進行第2次PCR檢測，獲得11個陽性株系。經(jīng)第1次PCR檢測為陽性的5、20號株系，在第2次檢測時為陰性，原因可能是轉化株系在第1次檢測時尚有少量殘留農(nóng)桿菌侵染，而在第2次檢測時已無農(nóng)桿菌殘留。

3.3 轉基因表達的RT-PCR檢測

RT-PCR方法檢測外源基因的表達具有靈敏度高、特異性強、便捷快速以及對原始材料的質量要求較低等優(yōu)點［26］。Guo等［27］通過農(nóng)桿菌介導法轉化紫莖澤蘭時，在PCR檢測為陽性的7個株系中隨機挑選3個進行RT-PCR檢測，結果顯示均為陽性。Jia等［28］將外源的幾丁質酶基因轉入毛白楊以增強其抗爛皮病的能力，經(jīng)PCR檢測有16個株系為陽性，選取5個株系進行RT-PCR檢測，結果均為陽性。

在本研究中，選取 nptII基因進行RT-PCR檢測，主要考慮植物中幾丁質酶基因的同源性;因nptII基因在植物中不存在，該基因的表達一定程度可作為外源幾丁質酶基因表達的指示。目的基因與篩選標記基因的轉錄一般具有較一致的對應關系。Jayaraj等［29］利用農(nóng)桿菌介導法，將幾丁質酶基因chi-2和脂質轉移蛋白基因 ltp轉入胡蘿卜中，通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，沒有表達篩選標記基因bar的7個轉基因株系中2個目的基因的檢測結果也為陰性;Celikkol等［30］用農(nóng)桿菌介導法轉化扁豆，選用gus和nptII基因進行RT-PCR檢測，gus基因檢測結果為陰性的5號和7號轉基因株系的nptII基因檢測結果也為陰性;Lee等［31］用外殼蛋白基因 CMVP0-CP和nptII基因轉化辣椒，RT-PCR檢測結果表明，各株系nptII基因的轉錄結果均與CMVP0-CP基因一致。本研究選取5個陽性株系，對nptII基因進行RT-PCR檢測，有3個株系擴增出特異目的條帶。這進一步表明，導入的外源基因已經(jīng)整合于轉化植株的基因組中并正常轉錄。其余2個株系沒有擴增出特異目的條帶，是因為外源基因雖存在于轉化植株中，但未能進行正常轉錄，發(fā)生了基因沉默。在轉基因植株中外源基因的失活是普遍存在的現(xiàn)象。

3.4 幾丁質酶活性檢測

質粒DNA導入植物細胞后，大部分并未插到染色體上，而是以游離狀態(tài)存在。這部分質粒DNA在瞬時表達中起重要作用。在合適的條件下，轉化外源基因的瞬時表達通常在數(shù)小時后就能檢測到其表達的產(chǎn)物，并在1～2 d內(nèi)達到最高值，隨后又逐漸降低，至10 d后完全消失［25］。本研究在轉化至少6個月之后測定轉化植株的幾丁質酶活性，發(fā)現(xiàn)與未轉化植株相比，3個轉基因株系的幾丁質酶活性分別提高了61.65%、69.17%和115.04%。該結果充分說明，這不是外源轉基因的瞬時表達，而是外源基因整合到基因組DNA分子上的穩(wěn)定表達。劉偉華等［12］以CaMV 35S為啟動子，用菜豆幾丁質酶基因轉化小麥幼胚愈傷組織，3株轉基因植株葉片的幾丁質酶活性比未轉化植株分別提高了61.94%、65.35%和84.86%，感染白粉病的過程也比對照株延緩并且發(fā)病程度較輕，其中1株赤霉菌侵染后未擴展。Tohidfar等［32-33］研究發(fā)現(xiàn)，與非轉基因植株相比，轉化菜豆幾丁質酶基因的棉花植株中，幾丁質酶的活性增高了幾倍，且在溫室試驗中，這些轉基因植株對黃萎病均表現(xiàn)出更強的抗性。

本研究中3個轉基因株系的抑菌效果也明顯優(yōu)于未轉化植株。在這3個轉化株系中，酶活性最高的26號株系對3種真菌的抑菌效果均優(yōu)于另外2個株系，這可能與外源基因插入位點的不確定性有關。張志忠等［34］指出，導入外源幾丁質酶基因的轉基因植物對某些病原的抗性都會有所增強，且大多數(shù)轉化植物抗性增強的程度與其所表達出的幾丁質酶量呈正相關，但也有例外，這可能與物種、導入的目標植物、病原菌的種類等都有關系。

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