熊 云，袁祥波，劉 曉，胡啟文，蘇 鵬

（1.解放軍后勤工程學(xué)院 軍事油料應(yīng)用與管理工程系，重慶 401311；2.解放軍第三軍醫(yī)大學(xué) 微生物教研室，重慶 400030）

噴氣燃料中含有真菌等微生物［1－4］，這些真菌會(huì)以烴類為碳源進(jìn)行代謝。如果燃料含水，真菌會(huì)迅速增殖［5－7］，在油－水界面形成頭皮狀懸浮物，給燃料潔凈性帶來危害。

噴氣燃料中懸浮物的產(chǎn)生與其中的水、表面活性劑、固體顆粒污染物、外界纖維等有十分復(fù)雜的關(guān)系［8－12］，而真菌菌絲是否參與構(gòu)成懸浮物的形成則尚無定論。

目前，中國A油庫、B油庫長期儲(chǔ)存的噴氣燃料出現(xiàn)懸浮物，其外觀、形貌均類似于真菌菌絲。為此，筆者對(duì)儲(chǔ)存噴氣燃料中懸浮物與真菌的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與儀器

2個(gè)含有懸浮物的噴氣燃料油樣，分別取自A油庫6號(hào)罐底部和B油庫71號(hào)罐底部。

沙保氏培養(yǎng)基（去離子水100mL，葡萄糖4g，瓊脂2g，蛋白胨1g，pH＝7.0），PDA培養(yǎng)基（去離子水500mL，瓊脂10g，去皮馬鈴薯100g，葡萄糖10g），真菌DNA提取液，瓊脂糖凝膠，溴化乙錠溶液。

Genesis Apex公司EDAX型能量色散X衍射分析（EDX）儀，奧林巴斯公司BX41型光學(xué)顯微鏡，日立公司S-3700N型掃描電子顯微鏡，KLOTZ型激光顆粒計(jì)數(shù)器，恒溫培養(yǎng)箱，電泳儀，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 噴氣燃料油中懸浮物的外觀形貌及元素組成測(cè)定

吸取71號(hào)罐底部油樣中的絮狀懸浮物，置于顯微鏡下觀察、拍照，并利用EDX儀分析其元素組成。

1.2.2 噴氣燃料加水促進(jìn)懸浮物生成的實(shí)驗(yàn)

將71號(hào)罐底部油樣搖勻后，準(zhǔn)確量取500mL油樣3份。第1份不作任何處理，第2份加入去離子水2mL，第3份用0.45μm濾膜過濾后加入2mL去離子水。搖勻，靜置，每隔一段時(shí)間觀察3份油樣中油－水界面情況，并測(cè)定燃料的顆粒數(shù)。

1.2.3 懸浮物真菌培養(yǎng)及鑒定［13－14］

吸取含懸浮物的噴氣燃料油樣中的絮狀懸浮物，置于沙保氏、PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)箱溫度35℃，培養(yǎng)5d。5d后觀察菌落形貌、顏色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲、孢子的結(jié)構(gòu)。根據(jù)其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，鑒別該真菌種類。

1.2.4 懸浮物的PCR擴(kuò)增及凝膠電泳檢測(cè)［15］

吸取含懸浮物噴氣燃料油樣中的絮狀懸浮物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對(duì)懸浮物進(jìn)行DNA擴(kuò)增。PCR試劑及用量如表1所示。

表1 噴氣燃料油樣中懸浮物PCR擴(kuò)增采用的試劑及用量Table 1 Reagent and dosage of PCR for suspended matters of jet fuel

PCR條件：95℃×300s，95℃×40s，53℃×40s，72℃×90s；30cycles，72℃×600s。

實(shí)驗(yàn)按模板類型分3組。1號(hào)在PCR試劑中加入1μL真菌DNA提取液作為模板，2號(hào)在PCR試劑中加入直徑1mm左右的71號(hào)罐底懸浮物樣品作為模板，3號(hào)在PCR試劑中加入直徑1mm左右的6號(hào)罐底懸浮物樣品作為模板。

反應(yīng)結(jié)束，分別取3組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（0.8%）檢測(cè)，用溴化乙錠染色，以Maker為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，6V/cm恒壓（100V），檢測(cè)時(shí)間20min。檢測(cè)結(jié)束后，在紫外燈下觀察PCR產(chǎn)物條帶。

2 結(jié)果與討論

2.1 懸浮物外觀形貌及元素組成

71號(hào)罐底部噴氣燃料中懸浮物的外觀形貌如圖1所示。其顯微鏡照片示于圖2。圖2（b）中所示長方形部位的EDX元素分析結(jié)果列于表2。

圖1 71號(hào)罐底部噴氣燃料中懸浮物的外觀形貌Fig.1 Appearance of suspended matters in jet fuel from the bottom of No.71tank

圖2 71號(hào)罐底部噴氣燃料中懸浮物的顯微鏡照片F(xiàn)ig.2 Micromorphology of suspended matters in jet fuel from the bottom of No.71tank

表2 圖2（b）中所示長方形部位的EDX元素分析結(jié)果Table 2 Element composition of the suspended matters shown in the rectangular part of Fig.2（b）analyzed by EDX

由圖1可知，與底部鐵銹及雜質(zhì)不同，懸浮物會(huì)飄散在燃料中，呈懸浮狀，容易辨認(rèn)。

由圖2可知，懸浮物是由結(jié)構(gòu)雜亂的絲狀物組成；絲狀物的直徑2～5μm，與菌絲直徑相當(dāng)；在絲狀物中能夠清晰地看到橫隔結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)為菌絲特有，可以作為辨別菌絲與纖維的證據(jù)。

由表2可知，懸浮物的元素組成主要為C、N、O，表明其主要由有機(jī)質(zhì)組成。

2.2 噴氣燃料加水促進(jìn)懸浮物生成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀察了不同加水條件下的3份油樣的油－水界面情況。其中，未過濾、未加入去離子水的油樣一直保持原貌不變；過濾、加入去離子水的油樣放置75d后仍保持清澈，油－水界面清晰可辨；未過濾、加入去離子水的燃料放置10d后變污濁，油－水界面模糊。對(duì)其顆粒數(shù)跟蹤檢測(cè)的結(jié)果列于表3～表5。

由表3可知，未過濾、未加入去離子水的噴氣燃料油樣放置75d，期間各級(jí)顆粒數(shù)無明顯變化。

由表4可知，未過濾、加入去離子水的噴氣燃料油樣放置5d后，各級(jí)顆粒數(shù)顯著增加。繼續(xù)放置，25μm以下的小顆粒變少，而50μm以上的大顆粒變多。加水會(huì)促進(jìn)噴氣燃料中真菌及孢子的繁殖，孢子數(shù)量在5d內(nèi)增多；繼續(xù)放置時(shí)真菌及孢子由小顆粒變?yōu)榇箢w粒，從而導(dǎo)致了油樣中小顆粒變少、大顆粒變多。

表3 未過濾、未加入去離子水油樣的顆粒數(shù)Table 3 The particle number of unfiltered jet fuel without adding deionized water

表4 未過濾、加入去離子水油樣的顆粒數(shù)Table 4 The particle number of unfiltered jet fuel with adding deionized water

表5 過濾、加入去離子水油樣的顆粒數(shù)Table 5 The particle number of filtered jet fuel with adding deionized water

由表5可知，過濾、加入去離子水的噴氣燃料油樣放置75d，期間各級(jí)顆粒數(shù)無明顯變化。過濾時(shí)真菌孢子（直徑3～5μm）被濾膜脫除，因此即使有水存在，也不會(huì)造成真菌繁殖，油樣中各級(jí)顆粒數(shù)基本保持不變。

2.3 噴氣燃料中懸浮物真菌培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

油樣中取出的懸浮物在沙保氏、PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d后均長出單一真菌菌落，如圖3所示。將其置于光學(xué)顯微鏡下觀察，其菌絲結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖3 噴氣燃料中懸浮物真菌培養(yǎng)所得未知真菌菌落的照片F(xiàn)ig.3Photos of unknown fungus colony cultivated in the suspended matters of jet fuel

圖4 噴氣燃料中懸浮物真菌培養(yǎng)所得未知真菌菌絲的光學(xué)顯微鏡照片F(xiàn)ig.4Micromorphology of hyphae of unknown fungus cultivated in the suspended matters of jet fuel

由圖3、圖4可知，該未知真菌菌絲的結(jié)構(gòu)、尺寸與圖2所示懸浮物的尺寸相一致，菌絲與懸浮物均有橫隔結(jié)構(gòu)，清晰可見；該真菌菌絲與懸浮物的差異在于，絮狀懸浮物序列雜亂、無規(guī)律，而在生長中的真菌菌絲順序條理雜而不亂；該菌的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)與芽枝霉屬的描述［16］相一致，即，分生孢子梗單生或簇生，暗色，在頂部或中部分支，分生孢子暗色，卵形至橢圓形。因此從形態(tài)學(xué)上可確定該菌為芽枝霉屬，是噴氣燃料中最常見的菌種［17－19］。

2.4 噴氣燃料中懸浮物PCR擴(kuò)增及凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

噴氣燃料中懸浮物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。圖5中，最左邊條帶為Maker條帶，①是以真菌DNA提取液為模板的PCR產(chǎn)物條帶，②是以71號(hào)罐底部油樣中懸浮物為模板的PCR產(chǎn)物條帶，③是以6號(hào)罐底部油樣中懸浮物為模板的PCR產(chǎn)物條帶。

圖5 噴氣燃料中懸浮物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Electrophoresis assay of the suspended matters in jet fuel after PCR amplification

由圖5可知，3條條帶的位置一致，均在300nt（nucleotide）左右，說明三者有相同的DNA片段；①號(hào)條帶較亮，說明真菌DNA提取液PCR擴(kuò)增效果好；②號(hào)條帶較暗，原因可能為加入的懸浮物中DNA含量偏少或者DNA未能完全地從懸浮物中釋放出來；③號(hào)條帶亮度適中。②③號(hào)條帶說明，71號(hào)罐和6號(hào)罐底部油樣懸浮物中均含有真菌DNA。

3 結(jié) 論

（1）儲(chǔ)存噴氣燃料中懸浮物直徑為2～5μm，在顯微鏡下能看到真菌菌絲特有的橫隔結(jié)構(gòu)；EDX顯示懸浮物的元素主要為C、N、O，懸浮物主要由有機(jī)質(zhì)組成。

（2）過濾（除去孢子）后的噴氣燃料加入去離子水后，各級(jí)顆粒數(shù)無明顯變化；未過濾（含有孢子）的噴氣燃料加入去離子水后，各級(jí)顆粒數(shù)顯著增加。

（3）噴氣燃料中懸浮物在沙保氏、PDA培養(yǎng)基上能長出真菌菌落，在顯微鏡下觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)其菌絲的結(jié)構(gòu)、尺寸與懸浮物的相一致，鑒定其為噴氣燃料中最常見的芽枝霉屬真菌。

（4）PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表明，71號(hào)罐和6號(hào)罐底部油樣懸浮物中均含有真菌DNA。

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