鐘 倩

（四川省威遠縣嚴陵鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，四川 威遠 642450）

紅假單胞菌屬于光合細菌的一種，而光合細菌是一類能在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用有機物作供氫體兼碳源進行不放氧光合作用的微生物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、有機肥生產(chǎn)等方面具有廣泛的應(yīng)用。光合細菌的生長受很多因素的影響，而鹽度會直接影響它的生長。本文通過連續(xù)平板涂布法從混合光合細菌中分離篩選出紅假單胞菌，然后將其接種在有機肥中進行光照厭氧培養(yǎng)，研究有機肥鹽度對紅假單胞菌生長的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種來源 光合細菌菌株由重慶江合生物技術(shù)有限責任公司提供，紅假單胞菌菌種是從含有紅假單胞菌的二級光合細菌菌液中分離純化而得。

1.2 有機肥樣品 有機肥由重慶永豐農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限責任公司提供，產(chǎn)品主要由雞糞經(jīng)過有氧發(fā)酵而成。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 分離培養(yǎng)基。乙酸鈉3.0g、丙酸鈉0.3g、氯化鈉0.1g、硫酸銨0.3g、七水硫酸鎂0.2g、磷酸氫二鉀0.3g、磷酸二氫鉀 0.5g、氯化鈣 0.05g、硫酸錳 0.025g、酵母膏0.1g、蛋白胨0.1g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，混合，將pH調(diào)至7.2～7.4，經(jīng)121℃高壓滅菌30min，即成固體分離培養(yǎng)基。再用同樣的培養(yǎng)基分離富集紅假單胞菌和擴大培養(yǎng)分離出的菌種。

1.3.2 不同鹽度有機肥培養(yǎng)基的配制。取無菌培養(yǎng)皿12個，6個梯度鹽度，每個梯度配制2個培養(yǎng)基。取100g有機肥溶于100mL水中，通過加入NaCl母液調(diào)控每個鹽度梯度，再加入瓊脂2g，121℃下高壓滅菌20min，即成有機肥培養(yǎng)基。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種培養(yǎng)方法。將配制好的培養(yǎng)基分裝于150mL錐形瓶中，裝液量為120mL，用8層紗布牛皮紙封口，液面鋪一層無菌液體石蠟隔絕氧氣，121℃下滅菌20 min。接種純菌種5%，于光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72～96h（溫度 28～31℃，光照強度 1500～3000勒克斯）。

1.4.2 菌種分離。從重慶江合生物技術(shù)有限責任公司取來的菌種本身是經(jīng)過富集的優(yōu)勢種為紅螺菌科的菌液，因此通過分離培養(yǎng)基反復(fù)震蕩培養(yǎng)和分離，重復(fù)幾次，直至鏡檢出純培養(yǎng)物，即可得到分離后的菌種懸浮液。將配制好的分離培養(yǎng)基分別制成無菌固體瓊脂培養(yǎng)基和無菌液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基滅完菌加2%酒精。挑取紅色單個菌落，劃線接種于固體培養(yǎng)基上，表層再覆蓋無菌瓊脂，制成厭氧培養(yǎng)基，光照厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30℃、3000勒克斯（lx）光照強度。待出現(xiàn)紅色菌落，連續(xù)如此分離3次即可分離出純培養(yǎng)假單胞菌株。觀察菌落形態(tài)特征，鏡檢確定為純培養(yǎng)物，然后做細菌標本片，觀察菌體形態(tài)特征。最后挑取純培養(yǎng)物穿刺于半固體瓊脂柱中，上面覆蓋一層約2 cm高的無菌混合石蠟，待長出豐滿的穿刺物后，備用或作菌種保存。配制液體培養(yǎng)物：挑取純培養(yǎng)物于之前配制好的滅菌液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基上面鋪一層1～2 cm液體石蠟，30℃、3 000 lx光照條件下厭氧培養(yǎng)，后期試驗備用。

1.4.3 菌種鑒定。革蘭氏染色 ：將純培養(yǎng)物接種于液體培養(yǎng)基中，光照厭氧條件下培養(yǎng)18h左右，對菌體進行革蘭氏染色。菌落形態(tài)、培養(yǎng)特征和菌體形態(tài)學觀察：待培養(yǎng)皿中長出菌落時，觀察瓊脂平板上生長的菌落形態(tài)及顏色，并制成細菌標本片，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.4.4 有機肥不同鹽度的設(shè)置。鹽度設(shè)置為6個梯度，分別為 0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，每個梯度設(shè)置2個重復(fù)，鹽度采用NaCl母液調(diào)控，28℃下光照厭氧恒溫箱中培養(yǎng)。

1.4.5 紅假單胞菌的計數(shù)。采用平板菌落計數(shù)法將之前保存好的菌種懸液依次稀釋至 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，在振蕩機上振蕩，使菌液充分混合。每個梯度的鹽度設(shè)2個培養(yǎng)皿，分別加入10-7稀釋度的菌種液，每個梯度2個重復(fù)。用2支1mL無菌吸管分別吸取10-7的稀釋液各0.1mL，放入已做好的含不同鹽度值有機肥培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用無菌玻璃棒將菌液涂布均勻，并覆蓋一層液體石蠟，立即放入同一生化培養(yǎng)箱中，調(diào)至30℃、3000lx下進行光照厭氧培養(yǎng)。48h后，取出培養(yǎng)平板，對各培養(yǎng)皿中形成的菌落計數(shù)，算出不同稀釋度、相同鹽度的平板上形成的平均菌落個數(shù)，并按下列公式進行計算：1mL菌種懸浮液中菌落形成單位（cfu）＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

2 試驗結(jié)果

2.1 分離菌落的形態(tài)特征 挑取3株菌株在平板上劃線培養(yǎng)（黑暗好氧條件下），分別編號 A1、A2、A3，第5d觀察到菌株均生長良好，然后經(jīng)分離培養(yǎng)基連續(xù)3次平板劃線培養(yǎng)后，分離出單個菌落，觀察其形態(tài)特征。鏡檢結(jié)果詳見表1。

表1 分離菌落的形態(tài)特征

2.2 純培養(yǎng)菌株的形態(tài)特征及培養(yǎng)特征 取分離得到的純培養(yǎng)物制作細菌抹片，分別編號B1、B2、B3，在顯微鏡下觀察，其形態(tài)學特征及光照厭氧培養(yǎng)的特征如表2所示。

從表1、表2可知，黑暗好氧條件下，菌種不一定呈紅色，而光照厭氧培養(yǎng)時，液體呈紅色，說明其體內(nèi)不一定含有紅色光和色素，但在光照條件下，它能迅速合成紅色光和色素。

表2 純培養(yǎng)菌株的形態(tài)及光照厭氧培養(yǎng)特征

由表1、表2可以看出，3個菌株均為卵形或桿狀，以單根極生鞭毛運動；主要以二分裂或不對稱分裂為增殖方式；革蘭氏染色呈陰性；厭氧光照和好氧黑暗條件下均能生長；液體培養(yǎng)的菌種呈紅色。這些特征與《伯杰細菌鑒定手冊》（第8版）所描述的紅假單胞菌屬相符，因此該分離出的純培養(yǎng)物為紅假單胞菌屬。

2.3 平板菌落計數(shù)結(jié)果 詳見表3。

表3 不同鹽度培養(yǎng)基中細菌的生長情況

從表3可以看出，紅假單胞菌在給定的鹽度范圍內(nèi)均能生長，在鹽度為0.4%時生長最好，隨著w（NaCl）的繼續(xù)升高，紅假單胞菌的生長情況直線下降。

3 分析與討論

3.1 鹽度對紅假單胞菌的影響 有機肥中鹽度直接影響光合細菌的生長。由于培養(yǎng)基的鹽度是由不同離子組成的，鹽度的高低其實是離子濃度的高低，因此，對鹽度適應(yīng)能力的不同，顯示了菌株對營養(yǎng)物質(zhì)吸收能力的不同。分離出的紅假單胞菌在鹽度為0～0.8%范圍內(nèi)生長良好，且在0.4%時生長最好，說明該菌適應(yīng)低鹽水體。所以應(yīng)根據(jù)不同的水質(zhì)情況，選擇合適的光合菌株。

3.2 鹽度對培養(yǎng)基的影響 高鹽度的培養(yǎng)基會降低營養(yǎng)物質(zhì)的數(shù)量，營養(yǎng)物質(zhì)在低鹽度時比在高鹽度和不加氯化鈉時要多，低鹽度對營養(yǎng)物質(zhì)有保護作用，但隨著濃度的增加，保護作用隨之降低，當濃度達較高時，營養(yǎng)物質(zhì)的耐熱性顯著減弱，直接影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的保存，最終影響到紅假單胞菌株的生長繁殖。

4 結(jié)論

采用連續(xù)平板涂布法能從混合光合細菌中分離篩選出紅假單胞菌；有機肥中的鹽度直接影響紅假單胞菌的生長，在鹽度為0～0.8%范圍內(nèi)生長良好，且在0.4%時生長最好。

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