杜李繼， 顧 菊， 陳光朗， 孫成磊， 陽(yáng)立波， 曹樹(shù)青

（合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

0 引 言

轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白分子，在擬南芥中鑒定了1 600多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子［1］，其中MYB基因占整個(gè)轉(zhuǎn)錄因子總數(shù)的9%［2］，其特征是N端具有高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域。MYB基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用［3］。MYB基因可分為 R1R2R－MYB、R2R3－MYB 和 R1－MYB 3類(lèi)［4］。絕大多數(shù)MYB蛋白被鑒定為正調(diào)控因子，但也有少數(shù)為負(fù)調(diào)控因子［5］。目前，這類(lèi)抑制因子被認(rèn)為屬于R2R3家族的亞類(lèi)，研究證實(shí)，有些MYB基因的過(guò)量表達(dá)可顯著增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性［6］。

大多數(shù)擬南芥MYB基因的表達(dá)受到1種或多種激素或脅迫的誘導(dǎo)，這說(shuō)明了該基因家族在逆境脅迫應(yīng)答方面的重要性［7］。本文利用RTPCR方法克隆了AtMYB50和AtMYB61基因的cDNA，并構(gòu)建了pET－32a＋和pGEX－4T－1原核表達(dá)載體和蛋白，為后續(xù)對(duì)這2個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用及其對(duì)下游靶基因調(diào)控的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥（Arabidopsisathaliana）哥倫比亞野生型（Col－0），購(gòu)于美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心，由本實(shí)驗(yàn)室繁衍保存。

1.1.2 主要試劑

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Fermentas公司；RNAiso Plus總RNA抽提試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶BamH I、Sal I和 Xho I、PrimeSTAR MAX DNA Polymerase購(gòu)于TaKaRa公司；T4DNA連接酶、pEASY－Blunt Simple Cloning Kit、Easy Taq、BL21（DE3）plysS Chemically Competent Cell購(gòu)于北京Transgen公司；TIANGel MiDi Purification Kit、TIANquick MiDi Purification Kit、TIANprep Mini Plasmid Kit購(gòu)于天根公司。

1.1.3 宿主菌和載體

平末端載體為pEASY－Blunt Simple Cloning Kit，感受態(tài)細(xì)胞為 Trans1－T1Chemically Competent Cell，原核表達(dá)大腸桿菌菌株為BL21（DE3）plysS Chemically Competent Cell，原核表達(dá)載體為pET－32a＋和pGEX－4T－1。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥植株培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)將Col－0種子用75%乙醇浸洗1min，然后用移液槍除去乙醇溶液，再用5%次氯酸鈉浸洗2min，用無(wú)菌水洗5次以除去殘留次氯酸鈉液，將種子晾干后點(diǎn)于MS固體培養(yǎng)基上，于4℃春化3d，最后置于光強(qiáng)度為100μmol／（m2·s）、光周期為16／8h、培養(yǎng)溫度為23℃的條件下培養(yǎng)3周。

1.2.2 擬南芥AtMYB50、AtMYB61基因克隆

RNAiso Plus總RNA抽提試劑盒抽提組織中總RNA，詳細(xì)方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

以總RNA為模板，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)TAIR中提供的基因cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并在正向和反向引物的5′端加上所需的酶切位點(diǎn)。其中AtMYB50R－pGE引物的酶切位點(diǎn)前多加1個(gè)堿基C，防止在蛋白表達(dá)時(shí)移碼。實(shí)驗(yàn)所需引物及酶切位點(diǎn)如下：

以cDNA為模板用PrimeSTAR MAX DNA Polymerase高保真擴(kuò)增酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性5min，98℃變性15s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并回收純化目的條帶。

將回收純化的基因片段與pEASY－Blunt Simple Cloning Kit平末端載體連接，轉(zhuǎn)入Trans1－T1感受態(tài)細(xì)胞中，用含有100μg／mL氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并接種于100μg／mL Amp－LB液體培養(yǎng)基，37℃、O／N 培養(yǎng)。用TIANprep Mini Plasmid Kit抽提質(zhì)粒，用雙酶切切下目的條帶，電泳檢測(cè)，回收純化。測(cè)序并確認(rèn)序列無(wú)誤。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

pET－32a＋和pGEX－4T－1用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行完全雙酶切，電泳檢測(cè)并回收載體片段，與回收好的目的基因片段相連，轉(zhuǎn)化至Trans1－T1感受態(tài)細(xì)胞，用含有100μg／mL氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。挑取單菌落，置于100μg／mL Amp－LB液體培養(yǎng)基，37℃、O／N培養(yǎng)。用 TIANprep Mini Plasmid Kit抽提質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證，雙酶切驗(yàn)證，即為構(gòu)建好的原核表達(dá)載體。

1.2.4 重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21（DE3）plysS Chemically Competent Cell，用含有100μg／mL氨芐青霉素（Amp）和20μg／mL氯霉素（Chl）的 LB固體雙抗培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。挑取單菌落，置于100μg／mL Amp－LB、20μg／mL Chl雙抗液體培養(yǎng)基，37℃、O／N培養(yǎng)，菌液PCR驗(yàn)證。

1.2.5 目的蛋白表達(dá)及SDS－PAGE電泳

將轉(zhuǎn)化至表達(dá)載體的BL21菌株接種于100μg／mL Amp－LB培養(yǎng)基，37 ℃、O／N 培養(yǎng)，然后加入IPTG，30℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3h，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。取100μL菌液5 000r／min離心，去上清液，用上樣緩沖液重懸菌體，沸水浴10min。制膠上樣，50V濃縮30min，然后100V分離1h。考馬斯亮藍(lán)染色10min后脫色液脫色，置于脫色搖床上過(guò)夜脫色，根據(jù)脫色情況更換脫色液。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增擬南芥基因

提取擬南芥植株總RNA，用RT Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增AtMYB50、AtMYB61基因片段。電泳結(jié)果與目的片段大小一致。AtMYB50目的基因如圖1a所示，長(zhǎng)度為942bp。AtMYB61基因如圖1b所示，長(zhǎng)度為1 098bp。

圖1 電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增目的片段

2.2 擬南芥基因連接轉(zhuǎn)化與質(zhì)粒酶切

將目的基因與pEASY－Blunt載體連接并導(dǎo)入大腸桿菌 Trans1－T1感受態(tài)細(xì)胞中，用含100μg／mL Amp的LB平板篩選陽(yáng)性單克隆。挑取單菌落于LB中擴(kuò)培，以菌液為模板進(jìn)行菌落PCR，重組質(zhì)粒菌落PCR結(jié)果電泳檢測(cè)分析及酶切驗(yàn)證如圖2所示。

由圖2可看出，擴(kuò)增出的條帶均為陽(yáng)性結(jié)果。用 BamH I 和 Sal I 對(duì) pEASY－Blunt－At-MYB50pET32和 pEASY－Blunt－AtMYB50pGEX質(zhì)粒完全雙酶切，將AtMYB50基因從重組載體上切下，電泳檢測(cè)回收純化。同樣用BamH I和Xho I對(duì) pEASY－Blunt－AtMYB61pET32重組載體完全酶切，電泳檢測(cè)并回收純化。酶切所得片段帶有酶切位點(diǎn)的黏性末端，可與雙酶切后的表達(dá)載體相連。

圖2 重組質(zhì)粒菌落PCR結(jié)果電泳檢測(cè)及酶切驗(yàn)證

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.3.1 完全雙酶切原核表達(dá)載體

用BamH I、Sal I雙酶切 pET－32a＋載體，BamH I、Xho I完全雙酶切pET－32a＋載體，酶切后的pET－32a＋載體約為5.9kbp，如圖3a、圖3b所示。BamH I、Sal I雙酶切pGEX－4T－1載體，酶切后約4.9kbp，如圖3c所示，電泳檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證了酶切結(jié)果。

圖3 載體酶切回收后電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3.2 原核表達(dá)重組載體的構(gòu)建

將雙酶切回收所得的含有黏性末端的目的基因片段和酶切回收后含有黏性末端的原核表達(dá)載體相連［8］，用T4DNA連接酶于25℃10min，立即轉(zhuǎn)化Trans1－T1感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)活化后涂布于含有Amp（100μg／mL）抗性的LB平板上，陽(yáng)性菌落在10～12h后長(zhǎng)出。挑取單菌落，置于100μg／mL Amp－LB液體培養(yǎng)基，37℃、O／N 培養(yǎng)。用TIANprep Mini Plasmid Kit抽提質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證，雙酶切驗(yàn)證。將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株BL21，用于原核表達(dá)目的蛋白。

2.4 目的蛋白的表達(dá)及水溶性鑒定

轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體的BL21菌株37℃、O／N培養(yǎng)，然后加入IPTG，30℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3h，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，SDS－PAGE電泳檢測(cè)有目的條帶，說(shuō)明目的蛋白表達(dá)成功。

在菌體破碎后對(duì)蛋白進(jìn)行分離和純化，對(duì)蛋白水溶性進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 融合蛋白的水溶性鑒定

由圖4可知，融合表達(dá)蛋白主要存在于細(xì)胞碎片沉淀中，細(xì)胞破碎上清中也含有部分蛋白，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步進(jìn)行蛋白純化。

為使重組表達(dá)載體在表達(dá)菌株中最優(yōu)表達(dá)［9］，獲得大量目的蛋白，對(duì)原核表達(dá)的條件（IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間等）進(jìn)行了優(yōu)化，在溫度為30℃下用濃度為1.0mmol／L的IPTG誘導(dǎo)2h，表達(dá)的蛋白量最大。

目的蛋白表達(dá)條件優(yōu)化如圖5所示。

圖5 目的蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

3 討 論

MYB基因不僅調(diào)控植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，而且參與了逆境脅迫的應(yīng)答調(diào)節(jié)。因此，研究該家族基因的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有十分重要的意義。MYB50和MYB61屬于R2R3的亞類(lèi)，在植物抗環(huán)境脅迫的調(diào)節(jié)中起著非常關(guān)鍵的作用。此外AtMYB50和AtMYB61在MYB家族中有非常近的親緣關(guān)系，其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有非常高的序列一致性，因此兩者可能對(duì)下游靶基因起到協(xié)同調(diào)控的作用。本文利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化了MYB50和MYB61蛋白，為進(jìn)一步研究2個(gè)基因的生化功能，特別是AtMYB50和AtMYB61蛋白之間相互作用及對(duì)下游靶基因的調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

隨著一些抗逆基因的鑒定和抗逆機(jī)理研究不斷深入，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源抗逆基因?qū)胫参锘蚪M，在提高植物抗逆性、改良農(nóng)作物遺傳性狀及培育農(nóng)作物優(yōu)良品系等方面具有廣闊的應(yīng)用前景［10－11］。

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