陳小璇，代劍平，朱丹霞，王革非，李康生

汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室，廣東 汕頭515041

青黛是由菘藍(lán)(Isatis Indigotica)、板藍(lán)根(baphicacanthus cusia Bremek)和馬藍(lán)(strobilanthes formosanus moore)等植物加工而成的深藍(lán)色粉末;咸，寒，歸肝經(jīng);清熱解毒、涼血定驚;含靛玉紅、靛藍(lán)、色胺酮和青黛酮等?，F(xiàn)代研究顯示青黛具有清熱抗炎、抗菌抗病毒和抗腫瘤等活性;可清除羥自由基，抑制ROS 產(chǎn)生;抑制人中性粒細(xì)胞ERK/p38/JNK MAPK 信號通路［1-2］。臨床青黛還常用于多種潰瘍，如潰瘍性結(jié)腸炎、糖尿病慢性下肢潰瘍、口腔潰瘍和消化性潰瘍?！扒圜旃嗄c”現(xiàn)已成為臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎常用方法［3］。潰瘍愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程。成纖維細(xì)胞老化衰退、胞外基質(zhì)沉積障礙、慢性炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長因子缺失、感染、缺血或神經(jīng)病變等都可導(dǎo)致慢性潰瘍［4］。其中，成纖維細(xì)胞增殖能力過低和適宜的細(xì)胞外基質(zhì)的缺失是慢性潰瘍常見的發(fā)病機(jī)制［5］。任何干擾成纖維細(xì)胞正常功能的刺激都會防礙傷口正常愈合，導(dǎo)致慢性難愈性潰瘍［6］。目前青黛的藥理研究多集中在抗炎方面，關(guān)于青黛對成纖維細(xì)胞的直接影響沒有任何報(bào)道。本研究擬探討青黛對小鼠結(jié)腸黏膜成纖維細(xì)胞增殖和膠原積累的影響及其潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 青黛購自鎮(zhèn)江存仁堂有限責(zé)任公司(鎮(zhèn)江，中國)，經(jīng)韓邦興博士(江蘇大學(xué)，中國)鑒定，高效液相色譜(JASCO，日本)檢測顯示其靛玉紅、靛藍(lán)和色胺酮含量分別為0. 589 mg/g、0. 512 mg/g 和0. 065 mg/g 原生藥。青黛提取物制備:稱100 g 青黛，加700 ml 雙蒸水，100 ℃，3 次，2 h/次，收集上清，命名為水提物;沉積物繼續(xù)加700 ml 95%乙醇，70 ℃，3 次，2 h/次，收集上清，命名為醇提物(非水溶性成分)。另取青黛100 g，先700 ml 雙蒸水，100 ℃，3 次，2 h/次，然后700 ml 95%乙醇，70 ℃，3 次，2 h/次，最后混合上清，命名為總提物。真空干燥，待用。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和MTT 實(shí)驗(yàn) Balb/c 小鼠50 只，平均體質(zhì)量(20 ±2)g，雌雄各半。正常飼養(yǎng)1 周，頸椎脫臼處死，無菌剝?nèi)〗Y(jié)腸黏膜，小鼠結(jié)腸黏膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法參照之前文獻(xiàn)［7］。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心審批。人永生化表皮細(xì)胞(HaCaT)用含10%胎牛血清(FCS)的1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)。青黛水提物、醇提物和總提物對小鼠黏膜成纖維細(xì)胞和HaCaT 細(xì)胞生長的影響用MTT 法測定［7］。青黛水提物、醇提物和總提物系列濃度(12. 5、25、50、100、200 μg/ml)用1% FCS DMEM 培養(yǎng)液配制，DMSO≤0.5%。藥物處理48 h，空白對照為1% FCS DMEM培養(yǎng)液(DMSO=0.5%)。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶分析 構(gòu)建人膠原蛋白基因α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)啟動子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，人膠原基因α1(Ⅰ)(COL1A1，NW_004078092.1)和α1(Ⅲ)(COL3A1，NW_004078008.1)啟動子序列分別插入pGL3-Basic，并命名為pCol1A1-p-Luc 和pCol3A1-p-Luc?？寺OL1A1 啟動子引物為F:5＇-AAAGGTACCACATATGGGGAGGGGCGGGGAGC-3＇，R:5＇-AGGCTCGAGCCTCTTGGCCGTGCGTCA GGA-3＇(2 042 bp);克隆COL3A1 啟動子引物為F:5＇-GGGGGTACCTGCATATAACAGCCTTTCCCCAG-3＇，5＇-AAACTCGA GAGTGGGATGAAGCAGAGCGAG-3＇(2 068 bp)。人HaCaT 細(xì)胞(1 ×104/孔)接種96 孔板，Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染，pRL-CMV 質(zhì)粒為內(nèi)參。37 ℃，6 h，PBS 洗3 次，然后分別加12.5 μg/ml 水提取物、25 μg/ml 醇提取物、25 μg/ml 和50 μg/ml 總提取物。24 h，收集細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(BD Biosciences Clontech，美國)測定熒光素酶活性。

1.4 羥脯氨酸測定 小鼠結(jié)腸黏膜成纖維細(xì)胞(1 ×105/孔)接種24 孔板，24 h，再加含12.5 μg/ml 水提取物、25 μg/ml 醇提取物、25 μg/ml 和50 μg/ml 總提取物的1%FCS DMEM 培養(yǎng)液，48 h，收集上清，氯胺T 法測羥脯氨酸含量［7］。膠原蛋白量用μg/106個(gè)細(xì)胞表示，假定膠原蛋白含13. 5% 羥脯氨酸。另，為確定PKC 和ERK MAPK 信號通路是否對青黛總提物誘導(dǎo)膠原蛋白產(chǎn)生有重要作用，我們用青黛總提物(25 μg/ml 和50 μg/ml)處理細(xì)胞，同時(shí)加入濃度為10 μmol/L PKC 抑制劑(Calphostin C)和ERK 抑制劑(U1026)，最后測定膠原蛋白水平。

1.5 明膠酶譜分析 小鼠黏膜成纖維細(xì)胞處理同羥脯氨酸測定。收集上清，用于明膠酶譜分析和ELISA測定;收集細(xì)胞用于qRT-PCR 和Western blotting 分析。MMP-2/-9 活性用Bandscan 軟件進(jìn)行灰度掃描并用面積×平均灰度值表示［7］。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR) 小鼠黏膜成纖維細(xì)胞處理同羥脯氨酸測定。Trizol 提取總RNA，核酸酶DNase I 處理，反轉(zhuǎn)錄并做實(shí)時(shí)定量PCR。試劑盒購自Invitrogen 并按說明書進(jìn)行。引物設(shè)計(jì)用Primer Express 3.0 軟件(見表1)。結(jié)果表示為2-ΔΔCt。

表1 引物序列表Tab 1 The sequences of primers

1.7 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA) 小鼠黏膜成纖維細(xì)胞處理同羥脯氨酸測定。ELISA 試劑盒(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)測定上清液TIMP-1、TIMP-2、CTGF、TGFβ1、IL-6、TNF-α 和IL-1 水平，結(jié)果用pg/ml表示。

1.8 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting) 小鼠黏膜成纖維細(xì)胞處理同羥脯氨酸測定?？笰kt、p-Akt、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、p-PKC(pan)和PKC(pan)抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗山羊二抗均購自CST 公司(美國)。蛋白質(zhì)濃度測定用BCA 蛋白測定試劑盒(碧云天，中國)，20 mg 蛋白質(zhì)上樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳［8］。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS 13.0 單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青黛提取物對小鼠黏膜成纖維細(xì)胞增殖和膠原積累的影響 MTT 實(shí)驗(yàn)顯示:青黛水提物能劑量依賴性地促進(jìn)小鼠黏膜成纖維細(xì)胞增殖，醇提物則劑量依賴性地抑制小鼠黏膜成纖維細(xì)胞增殖，總提物在低濃度(25 μg/ml ～50 μg/ml)時(shí)能顯著促進(jìn)小鼠黏膜成纖維細(xì)胞增殖。青黛水提物和總提物最小有效濃度分別為12.5 μg/ml 和25 μg/ml，醇提物最大無細(xì)胞毒性濃度為25 μg/ml(見圖1A)。羥脯氨酸實(shí)驗(yàn):青黛水提物可促進(jìn)膠原積累;醇提物可降低膠原積累，但處理組與空白組(1% FCS)相比無顯著性差異;青黛總提物在12.5 ～50 μg/ml 濃度下可顯著促進(jìn)膠原積聚(見圖1B)。另外，熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒實(shí)驗(yàn):水提物(12.5 μg/ml)和總提物(25 μg/ml 和50 μg/ml)均能顯著提高熒光素酶活性，說明兩者均能激活膠原基因COL1A1 和COL3A1 啟動子轉(zhuǎn)錄，但青黛醇提物無此活性(見圖2A ～B)。qRT-PCR 試驗(yàn)顯示相似的結(jié)果(見圖2C)。

圖1 青黛提取物對小鼠黏膜成纖維細(xì)胞增殖和膠原積累的影響 A:MTT 法測定青黛對小鼠黏膜成纖維細(xì)胞增殖的影響;B:氯胺T 法測定青黛提取物對MCF 細(xì)胞膠原積累的影響;圖2 青黛提取物對膠原基因COL1A1 和COL3A1 轉(zhuǎn)錄的影響 A ～B:pCol1A1-p-Luc 和pCol3A1-p-Luc 雙酶切結(jié)果和熒光素酶報(bào)道質(zhì)粒測定結(jié)果;C:qRT-PCR 試驗(yàn)結(jié)果Fig 1 Effects of indigo naturalis extracts on the proliferation and collagen accumulation of mice colonicfibrolasts A:effects of indigo naturalis extracts on the proliferation determined by MTT method;B:effects of indigo naturalis extracts on collagen accumulation determined by chloramine T method;Fig 2 Effects of indigo naturalis extracts on the transcription of procollagen genes COL1A1 and COL3A1 A ～B:double enzyme digestion of plasmids and the result of the luciferase reporter plasmid assay;C:result of qRT-PCR assay

2.2 青黛提取物對MMPs 和TIMPs 活性及生成的影響 明膠酶譜試驗(yàn)顯示:與空白組相比，水提物(12.5 μg/ml)和總提物(50 μg/ml)可顯著提高M(jìn)MP-2/-9 活性，總提物在25 μg/ml 時(shí)還可顯著提高M(jìn)MP-2活性;相反醇提物(25 μg/ml)卻顯著抑制MMP-2 活性(見圖3A ～C)。qRT-PCR 結(jié)果顯示:水提物(12. 5 μg/ml)和總提物(50 μg/ml)能顯著提高M(jìn)MP-1/-13轉(zhuǎn)錄，醇提物(25 μg/ml)抑制效果不顯著(見圖3D)。此外，qRT-PCR 和ELISA 檢測TIMP-1/-2 發(fā)現(xiàn):青黛水提物(12.5 μg/ml)及總提物(25 μg/ml 和50 μg/ml)均能顯著促進(jìn)TIMP-1/-2 產(chǎn)生，醇提物(25 μg/ml)對此無顯著效應(yīng)(見圖3D ～F)。

2.3 青黛提取物對細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄及釋放的影響TGFβ1、CTGF、IL-6、IL-1 和TNF-α 在傷口愈合中發(fā)揮重要作用［9］。qRT-PCR 和ELISA 試驗(yàn)顯示:水提物(12.5 μg/ml)能顯著促進(jìn)TGF-β1 和CTGF 轉(zhuǎn)錄和釋放;醇提物(25 μg/ml)可顯著抑制TGF-β1、CTGF、IL-6、IL-1 和TNF-α 轉(zhuǎn)錄和釋放;總提取物在25 μg/ml 和50 μg/ml 濃度時(shí)可顯著抑制IL-6、IL-1 和TNF-α 轉(zhuǎn)錄和釋放，但在50 μg/ml 濃度時(shí)能顯著促進(jìn)CTGF 轉(zhuǎn)錄和釋放(見圖4)。

2. 4 青黛提取物對AKT、PKC 和ERK/JNK/p38MAPK 信號通道的影響 Western blotting 試驗(yàn)顯示:青黛水提物(12. 5 μg/ml)可顯著提高p-Akt、p-PKC(pan)、p-ERK、p-JNK 和p-p38 磷酸化水平;醇提物(25 μg/ml)可顯著抑制Akt 和p38 MAPK 信號通路活化;總提取物(25 μg/ml 和50 μg/ml)可顯著抑制Akt 信號通路活化，但顯著激活PKC 和ERK MAPK 信號通路(見圖5)。PKC 抑制劑(Calphostin C)和ERK抑制劑(U1026)都可顯著拮抗青黛總提物誘導(dǎo)的膠原蛋白產(chǎn)生，這表明PKC 和ERK MAPK 信號通路在青黛總提物誘導(dǎo)膠原蛋白生成時(shí)起重要作用(見圖6)。

圖3 青黛提取物對MMPs 和TIMPs 活性及表達(dá)的影響 A ～C:明膠酶譜試驗(yàn)，1:1% FCS+水提物(12.5μg/ml);2:1% FCS+醇提物(25 μg/ml);3:1% FCS+總提物(50 μg/ml);4:1% FCS+總提物(25 μg/ml);5(空白):1% FCS;6(陽性):10% FCS;D:qRT-PCR 試驗(yàn)結(jié)果;E ～F:ELISA 試驗(yàn)結(jié)果。Fig 3 Effects of indigo naturalis extracts on the activity and production of MMPs and TIMPs A ～C:Gelatin zymography assay;D:qRT-PCR assay;E ～F:ELISA assay

3 討論

青黛常用于治療多種潰瘍，現(xiàn)臨床潰瘍性結(jié)腸炎患者?？诜圜旆刍蚯圜旃嗄c［3］。此外，青黛還可用于治療頑固性牛皮癬［10］，該病重要特征是基底層角朊細(xì)胞過度增生。從臨床應(yīng)用來看，青黛的藥理機(jī)制似乎有自相矛盾之處，即治療潰瘍時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增生創(chuàng)面愈合，在治療牛皮癬時(shí)抑制細(xì)胞增生。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青黛含兩種對小鼠黏膜成纖維細(xì)胞增殖和膠原積累作用相反的成分，青黛水提物可促進(jìn)小鼠黏膜成纖維細(xì)胞增殖和膠原積累，增強(qiáng)MMPs 和TIMP-1/-2 活性和產(chǎn)生，提高CTGF 和TGFβ1 水平，以及激活PI3K/Akt、PKC 和ERK/JNK/p38 MAPK 信號通道，所有這些有利于潰瘍愈合，但青黛醇提物(非水溶性成分)幾乎起相反作用，不僅抑制MCF 細(xì)胞增殖，抑制TGFβ1 和CTGF 轉(zhuǎn)錄和釋放，還抑制PI3K/Akt 和p38 MAPK 信號通路。為探討臨床口服青黛粉或青黛灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制，我們首先用水充分提取青黛，再用95%乙醇提取，最后混合，獲得總提取物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總提物在低濃度(25 ～50 μg/ml)下能促進(jìn)MCF 細(xì)胞增殖和膠原積累，提高M(jìn)MPs 和TIMP-1/-2 的活性及產(chǎn)生，提高CTGF 和TGFβ1 水平，并激活PKC 和ERK MAPK 信號通道，所有這些都有利于潰瘍愈合。因此，我們建議:在治療潰瘍時(shí)，總提取物是最佳的選擇，因?yàn)樗胸S富的水提物成分;在治療頑固性牛皮癬時(shí)，最好使用青黛醇提物。事實(shí)上，臨床已經(jīng)用青黛油治療頑固性牛皮癬，用以水溶性物質(zhì)為基質(zhì)的青黛灌腸劑來治療潰瘍性結(jié)腸炎［3，10］。

圖4 青黛提取物對細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄及釋放的影響 A:qRTPCR 試驗(yàn)結(jié)果;B:ELISA 試驗(yàn)結(jié)果Fig 4 Effects of indigo naturalis extracts on the transcription and release of cytokines A:qRT-PCR assay;B:ELISA assay

圖5 青黛提取物對AKT、PKC 和ERK/JNK/p38 MAPK 信號通道的影響Fig 5 Effects of indigo naturalis extracts on the activation of AKT，PKC and ERK/JNK/p38 MAPK signal pathways

圖6 PKC 抑制劑和ERK 對青黛總提物誘導(dǎo)膠原蛋白的影響Fig 6 Effects of PKC and ERK inhibitors on the indigo naturalis total extract-induced production of collagen

雖然過多的MMPs 可能有礙潰瘍愈合，但分泌型MMPs 能重塑基底膜，促細(xì)胞遷移，促表皮再生［11］?；蚯贸驧MP-3-/-、MMP-8-/-、MMP-9-/-和MMP-13-/-表現(xiàn)出顯著的傷口愈合延遲，MMP-3-/-傷口收縮力缺失，MMP-9-/-和MMP-13-/-細(xì)胞遷移速度顯著減緩［11］。MMPs 外源性抑制劑顯著延長傷口愈合［12］。在本試驗(yàn)中，青黛水提物和總提物都可提高M(jìn)MPs 活性和生成，這可能有助于基底膜重塑、細(xì)胞遷移和表皮再生，有利于潰瘍愈合。

據(jù)報(bào)道，PI3K/Akt 和ERK/JNK/p38 MAPK 信號通路在潰瘍愈合中起重要作用［13］。PKC 通路是細(xì)胞增殖和膠原合成所必需的，PKC-ε 活化可激活MEK/ERK，增強(qiáng)膠原表達(dá)［14］。IL-1β 活化PKC 和ERK/JNKs 途徑，促進(jìn)MMP-2/-9 表達(dá)［9］。本研究顯示，青黛總提物可顯著激活PKC 和ERK 信號通路，且PKC抑制劑(Calphostin C)和ERK 抑制劑(U1026)可顯著拮抗青黛總提物誘導(dǎo)膠原蛋白產(chǎn)生，由此推測，PKC和ERK 信號通路在青黛總提物促潰瘍愈合中發(fā)揮重要作用。

總之，青黛含有兩種對小鼠黏膜成纖維細(xì)胞功能影響相反的成分，青黛總提物可促進(jìn)結(jié)腸黏膜成纖維細(xì)胞增殖及膠原積累，提高M(jìn)MPs 和TIMP-1/-2 的活性及產(chǎn)生，上調(diào)TGFβ1 和CTGF 水平，其促進(jìn)潰瘍治愈的機(jī)制可能依賴于PKC/ERK MAPK 信號通路。

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