鄭龍志，林 偉，陳有挺，石 錚，何慶良

1.莆田學(xué)院附屬醫(yī)院普通外科，福建 莆田351100;2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科

膽管癌是指來(lái)源于膽管系統(tǒng)上皮組織的惡性腫瘤，其起病隱匿、缺乏典型的癥狀和體征，早期診斷困難;臨床上根治性切除率低，且對(duì)放化療不敏感，預(yù)后較差。因此，探索一條新的有效的治療途徑，對(duì)于膽管癌的治療具有十分重要的意義。他汀類藥物的作用具有多效性，它除有降血脂作用外，還具有抗腫瘤方面的作用［1］。本研究旨在研究阿托伐他汀(Atorvastatin，ATV)對(duì)QBC939 細(xì)胞侵襲的影響，探討其抗腫瘤作用及其可能的作用機(jī)制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):用人膽管癌QBC939 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn):應(yīng)用四唑鹽(MTT)比色法進(jìn)行體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞抑制率(%)=(對(duì)照組A 值-治療組A 值)/對(duì)照組A 值×100%;以時(shí)間為橫軸，細(xì)胞抑制率為縱軸繪制藥物濃度曲線圖，計(jì)算出藥物半數(shù)抑制濃度IC50及藥物最佳作用時(shí)間。藥物IC50為(26.361.84)μmol/L，本實(shí)驗(yàn)選用接近IC50的3個(gè)濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度:10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L，并以最佳作用時(shí)間48 h 為干預(yù)時(shí)間。

1.2.3 Matrigel 侵襲實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期QBC939 細(xì)胞，用無(wú)血清RPMI-1640 培養(yǎng)液洗滌3 次，制成1 ×106個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液，將上述配制的各組細(xì)胞懸液100 μl，分別加入Transwell 小室中，待細(xì)胞貼壁后，加入含不同濃度阿伐他汀的培養(yǎng)液，每一濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)室，以等量無(wú)藥液培養(yǎng)液為對(duì)照，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。取下Transwell 微孔濾膜在4%甲醛液中固定30 min，常規(guī)HE 染色。400 倍光鏡下觀察，隨機(jī)取5 個(gè)高

1 材料與方法

1.1 材料 人膽管癌細(xì)胞株QBC939 由第三軍醫(yī)大學(xué)王曙光教授建株，董家鴻教授惠贈(zèng);Transwell 小室購(gòu)自Corning 公司;Matrigel 膠購(gòu)自美國(guó)BD 公司?？贵w:抗RhoC 多克隆抗體購(gòu)自Upstate 公司，一步法RTPCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。倍視野，計(jì)數(shù)透膜細(xì)胞總數(shù)。

1.2.4 半定量RT-PCR 分析RhoC mRNA 的表達(dá):參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，一步法RT-PCR 擴(kuò)增目的基因，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以x ±s 表示，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATV 對(duì)QBC939 細(xì)胞的殺傷抑制作用 ATV 對(duì)人膽管癌QBC939 細(xì)胞的殺傷抑制作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)，在同一藥物濃度干預(yù)下，殺傷抑制作用隨干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而漸增;呈劑量-時(shí)間雙效應(yīng)關(guān)系(見(jiàn)圖1)。

2.2 ATV 對(duì)QBC939 細(xì)胞Matrigel 體外侵襲力的影響 對(duì)照組QBC939 細(xì)胞過(guò)膜較多，體外侵襲能力強(qiáng);藥物干預(yù)組隨著藥物濃度的提高，QBC939 細(xì)胞過(guò)膜逐漸減少，各濃度組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。結(jié)果表明，ATV 可抑制QBC939 細(xì)胞對(duì)體外模擬的基底膜的侵襲力，其抑制作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系(見(jiàn)圖2 ～3)。2.3 半定量RT-PCR 分析RhoC mRNA 的表達(dá) 經(jīng)10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L ATV 干預(yù)組后細(xì)胞RhoC mRNA 的表達(dá)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見(jiàn)表1)。

圖1 不同濃度ATV 對(duì)QBC939 細(xì)胞增殖抑制作用Fig 1 Inhibitory effects of proliferation of different concentrations ATV on QBC939 cells

圖2 不同濃度ATV 作用48 h 后QBC939 細(xì)胞過(guò)膜情況 A:對(duì)照組;B:10 μmol/L 濃度組;C:25 μmol/L 濃度組;D:50 μmol/L濃度組Fig 2 The membrane filtration of different con-cerntrations ATV on QBC939 cells after 48 hours A:control group;B:10 μmol/L concentration group;C:25 μmol/L concentration group;D:50 μmol/L concentration group

3 討論

目前腫瘤的治療以現(xiàn)代分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子免疫學(xué)等前沿科學(xué)為基礎(chǔ)，強(qiáng)調(diào)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的分子基礎(chǔ)和治療的針對(duì)性、有效性。因而尋找一種既能抗腫瘤細(xì)胞增殖，又能降低腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處侵襲能力的抗腫瘤藥物，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

他汀類藥物是80 年代后期開(kāi)發(fā)的一種新型調(diào)節(jié)血脂藥物，通過(guò)抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMGCoA)還原酶作用，減少甲羥戊酸(Mevalonic acid，MVA)合成及其下游產(chǎn)物，從而影響細(xì)胞許多重要的生物學(xué)功能:細(xì)胞膜構(gòu)成、糖蛋白合成、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞周期進(jìn)展等［2］。因此，他汀類藥物作用的多效性除降血脂作用外，還包括逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮功能異常、抗氧化劑活性、免疫調(diào)節(jié)、減少室性心律失常及血樁形成等作用［1］。近年來(lái)的體外研究還發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖，誘導(dǎo)分化或凋亡，抑制血管發(fā)生，降低侵襲、轉(zhuǎn)移能力及增強(qiáng)放化療等作用，是一種潛在的抗腫瘤藥物［1］;兩個(gè)大型的臨床研究也證實(shí)了在正常人和黑色素瘤患者中，他汀類藥物具有預(yù)防及抗腫瘤作用［3-4］。

圖3 不同濃度ATV 對(duì)QBC939 細(xì)胞侵襲力的影響Fig 3 Effects of invasion in different concentrations ATV on QBC939 cell

Tab 1 Expression of RhoC mRNA after intervented with different concentrations of ATV intervention (x±s)

表1 不同濃度ATV 干預(yù)后RhoC mRNA 的表達(dá)情況(x±s)

Boyden 小室侵襲實(shí)驗(yàn)是體外檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲力的經(jīng)典方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Matrigel 侵襲實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組QBC939 細(xì)胞透膜較多，體外運(yùn)動(dòng)能力較強(qiáng);而經(jīng)ATV 處理過(guò)的人膽管癌QBC939 細(xì)胞，其穿透Matrigel 膠的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且隨著ATV 濃度的提高透膜細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。ATV 藥物干預(yù)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);各濃度組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。本研究顯示，ATV 可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力及運(yùn)動(dòng)能力。

他汀類藥物可以抑制RhoC 的GGPP 活化修飾，導(dǎo)致胞漿中RhoC 的非活性(GDP 結(jié)合)形式富集而降低膜上RhoC 與GTP 的結(jié)合能力有關(guān)，最終導(dǎo)致RhoC 活性降低;從而影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，降低其侵襲、轉(zhuǎn)移能力［5］。結(jié)合本次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè):ATV 可能主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞Rho 蛋白的異戊烯化，即抑制Rho 的膜定位及其活性，從而影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，包括p27KIP1 蛋白的降解、RhoC 的GGPP 活化修飾及其對(duì)MMP-9 的調(diào)控，進(jìn)一步影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們將進(jìn)一步探討ATV 對(duì)RhoC 蛋白的異戊烯化的影響。

因此，我們認(rèn)為，ATV 可抑制細(xì)胞體外侵襲及運(yùn)動(dòng)能力，這可能為膽管癌的治療提供新的治療方法。

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