黃學(xué)飛，李 聞

1.海軍總醫(yī)院干部病房消化內(nèi)科，北京100048;2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科

梗阻性黃疸(obstructive jaundice，OJ)是臨床常見(jiàn)病，患者常并發(fā)感染死于敗血癥，提示OJ 患者免疫功能減退。內(nèi)毒素血癥是造成OJ 患者免疫功能損傷的主要因素，此時(shí)肝臟Kupffer 細(xì)胞的免疫功能受到抑制，清除內(nèi)毒素的能力下降，從而導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥的形成。近年來(lái)隨著內(nèi)鏡和超聲微創(chuàng)治療技術(shù)的發(fā)展，經(jīng)內(nèi)鏡膽汁內(nèi)引流術(shù)和經(jīng)皮經(jīng)肝膽汁外引流術(shù)成為減黃治療的主要手段。有研究顯示［1］，膽汁內(nèi)引流能明顯改善OJ 患者的內(nèi)毒素血癥，并恢復(fù)患者的肝功能和Kupffer 細(xì)胞免疫功能，而外引流術(shù)對(duì)改善內(nèi)毒素血癥的作用尚有爭(zhēng)論。CD14 作為表達(dá)于Kupffer 細(xì)胞表面的內(nèi)毒素的受體，可能參與了OJ 的免疫抑制過(guò)程，并與膽汁內(nèi)外引流術(shù)的不同結(jié)果相關(guān)。本研究通過(guò)觀察膽道梗阻及內(nèi)、外引流術(shù)解除梗阻對(duì)肝臟Kupffer 細(xì)胞CD14 表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討內(nèi)、外引流術(shù)在恢復(fù)梗阻性黃疸Kupffer 細(xì)胞免疫功能方面的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠60只，體質(zhì)量270 ～300 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在解放軍總醫(yī)院Ⅱ級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室分籠單獨(dú)飼養(yǎng)，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食與飲水，維持環(huán)境溫度15 ～20 ℃。

1.2 主要試劑 兔抗大鼠CD14 多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，PV-6001 二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒及濃縮型DAB 試劑盒(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立及分組:將60 只大鼠隨機(jī)分為4 組:假手術(shù)組(SH，n=15)、梗阻性黃疸組(OJ，n=15)、膽汁內(nèi)引流組(ID，n =15)、膽汁外引流組(ED，n=15)。采用改良的手術(shù)方法制備動(dòng)物模型。OJ 組:大鼠開(kāi)腹分離膽總管并結(jié)扎、切斷，建立OJ 模型;7 d后行第2 次手術(shù)，分離膽總管但不引流。ID 組:OJ 模型建成7 d 后二次手術(shù)，于擴(kuò)張的膽總管和十二指腸之間植入內(nèi)引流管。ED 組:OJ 模型建成7 d 后二次手術(shù)，從擴(kuò)張的膽總管末端插入外引流管，經(jīng)皮下引至頸背部體外并固定。SH 組:大鼠開(kāi)腹分離膽總管但不結(jié)扎，7 d 后二次手術(shù)分離膽管但不引流。觀察并記錄大鼠的一般情況及體質(zhì)量變化。各組大鼠均于二次手術(shù)后第7 天腹腔注射3%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉，開(kāi)腹留取肝臟組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋并切片備用。

1.3.2 肝臟Kupffer 細(xì)胞CD14 表達(dá)的測(cè)定:采用免疫組化方法，石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，高壓鍋抗原修復(fù)30 s，3% H2O2室溫孵育8 min，滴加1∶200 的兔抗大鼠CD14 抗體，4 ℃冰箱過(guò)夜;滴加二抗(山羊抗兔IgG 抗體-HRP 多聚體，PV-6001)，37 ℃，30 min 后，DAB 顯色。

1.3.3 圖像分析技術(shù):通過(guò)顯微圖像分析技術(shù)，測(cè)定CD14 陽(yáng)性反應(yīng)物的平均積分光密度值(IOD/area)，其中IOD 為待測(cè)定區(qū)域陽(yáng)性染色的積分光密度，area為待測(cè)定區(qū)域的面積。將切片置于與圖象分析系統(tǒng)相連的顯微鏡下(400 ×)，選定待測(cè)區(qū)，采集數(shù)據(jù)。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，取其平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所測(cè)數(shù)據(jù)均用x ±s 描述，多組間比較采用方差分析，P ＜0.01 為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量變化 SH 組大鼠體質(zhì)量增加明顯，而膽管結(jié)扎后，OJ 組大鼠體質(zhì)量增加比較緩慢。第7天和第14 天，假手術(shù)組與OJ 組大鼠體質(zhì)量比較，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。解除梗阻后，ID組大鼠體質(zhì)量增加明顯，而ED 組大鼠體質(zhì)量反而下降。第7 天ID 組和ED 組大鼠體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.678);而第14 天兩組大鼠體質(zhì)量比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01，見(jiàn)圖1)。

2.2 大鼠肝臟Kupffer 細(xì)胞CD14 的表達(dá) CD14 陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，甚至棕褐色，主要表達(dá)于Kupffer 細(xì)胞，表現(xiàn)為肝竇邊緣及匯管區(qū)的星形細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)。部分肝細(xì)胞及匯管區(qū)浸潤(rùn)的白細(xì)胞也可見(jiàn)黃染(見(jiàn)圖2)。圖像分析結(jié)果:SH 組、OJ 組、ID 組和ED 組肝臟CD14 染色的平均積分光密度值(IOD/area)分別為:0.001355 ±0.000822、0.015557±0.002135、0.001548±0. 001024、0. 008570 ± 0. 001893。OJ 組 大 鼠 肝 臟CD14 表達(dá)IOD/area 明顯增強(qiáng)，與SH 組IOD/area 比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);ID 組IOD/area與OJ 組比較明顯降低(P ＜0.01);而ED 組與OJ 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.5907，見(jiàn)圖3)。

圖1 4 組大鼠模型體質(zhì)量變化趨勢(shì)Fig 1 Changes of rats body weight among the four groups

3 討論

內(nèi)毒素受體CD14 是機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵因素之一。體內(nèi)CD14 存在兩種形式，表達(dá)于細(xì)胞表面的mCD14(membrane CD14)和血清中可溶性的sCD14(soluble CD14)。mCD14 表達(dá)于成熟的髓系細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、多形核細(xì)胞)、B 細(xì)胞表面。在肝臟CD14 主要表達(dá)于Kupffer 細(xì)胞。CD14 識(shí)別血中的內(nèi)毒素(LPS)并與其結(jié)合引發(fā)免疫細(xì)胞的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，激活NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子。CD14 在LPS 介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過(guò)程中處于核心地位因Kupffer 細(xì)胞是肝臟表達(dá)CD14 的主要細(xì)胞，因而實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟組織CD14 的表達(dá)變化反應(yīng)了Kupffer 細(xì)胞CD14 表達(dá)情況。在本研究中，OJ 組大鼠肝臟CD14 表達(dá)與SH 組比較明顯升高。CD14 表達(dá)的異常升高提示OJ 大鼠Kupffer 細(xì)胞被激活，并介導(dǎo)對(duì)內(nèi)毒素的免疫及炎癥反應(yīng)。Miyaso 等［2］報(bào)道OJ 時(shí)Kupffer 細(xì)胞CD14 的表達(dá)明顯增強(qiáng)。LPS 即是CD14 的配體又是CD14 表達(dá)的激活因素，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及體外研究均表明LPS 可以上調(diào)Kupffer 細(xì)胞CD14 的表達(dá)［3-4］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，OJ 患者有明顯的內(nèi)毒素血癥［5］。因此我們考慮OJ 大鼠Kupffer 細(xì)胞CD14 表達(dá)增高是內(nèi)毒素持續(xù)刺激的結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)膽汁內(nèi)引流術(shù)解除膽道梗阻后，大鼠肝臟CD14 的表達(dá)明顯下降;而外引流術(shù)后，大鼠肝臟CD14 的表達(dá)下降不明顯。表明膽汁內(nèi)引流術(shù)在恢復(fù)Kupffer 細(xì)胞CD14 表達(dá)方面優(yōu)于膽汁外引流術(shù)。這可能與引流方法致膽汁的得失有關(guān)。膽汁內(nèi)引流恢復(fù)了正常的膽汁排泄途徑，膽汁流入腸道，有利于抑制腸內(nèi)細(xì)菌的繁殖;另外排入腸道的膽汁可以協(xié)助食物的消化、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，恢復(fù)了腸肝循環(huán)，增強(qiáng)了機(jī)體免疫力［6］。盡管在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)膽汁外引流組大鼠血清內(nèi)毒素水平也可降低［7］，但膽汁外引流不能建立膽鹽正常的腸肝循環(huán)，膽汁中的大量膽鹽及sIgA 等通過(guò)外引流丟失，失去了對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用，容易誘發(fā)內(nèi)毒素及細(xì)菌入血。外引流大鼠體內(nèi)可能存在低水平的內(nèi)毒素持續(xù)刺激，從而激活Kupffer 細(xì)胞CD14 的表達(dá)，以清除持續(xù)進(jìn)入門脈的內(nèi)毒素和細(xì)菌。在我們的實(shí)驗(yàn)中也觀察到內(nèi)引流解除膽道梗阻以后，大鼠體質(zhì)量明顯增加，而外引流大鼠的體質(zhì)量反而下降，提示外引流大鼠由于膽汁丟失營(yíng)養(yǎng)狀況變差。推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中兩種引流方法所致大鼠肝臟Kupffer 細(xì)胞CD14 表達(dá)的差異可能與膽鹽、腸屏障、腸肝循環(huán)、和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)等因素有關(guān)。

圖2 4 組大鼠肝臟CD14 免疫組化染色結(jié)果(400 ×) A:SH 組，CD14 陽(yáng)性染色主要位于肝竇邊緣及匯管區(qū)的Kupffer 細(xì)胞胞膜，SH 組大鼠肝臟Kupffer 細(xì)胞CD14 染色較弱;B:OJ 組，CD14 染色明顯增強(qiáng);C:ID 組，CD14 陽(yáng)性染色較OJ 組明顯降低;D:ED 組，CD14 陽(yáng)性染色仍較明顯Fig 2 Representative immunohistochemical staining of CD14 in rats liver tissues among four groups (400 ×) A:In SH group，the positive staining of CD14 was detected mainly in the membrane of Kupffer cell on the edge of liver sinusoid and portal areas. There was slight expression of CD14 in SH group;B:In OJ group，the expression of CD14 was stronger as compared to SH group;C:In ID group，the expression of CD14 was markedly suppressed;D:In ED group，the expression of CD14 was still at a high level

圖3 4 組大鼠肝臟Kupffer 細(xì)胞CD14 表達(dá)情況比較Fig 3 Comparison of the expression of CD14 in rat liver Kupffer cells among four groups

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