佟延南，王德強(qiáng)*，李芳遠(yuǎn)，李忠琴

(1.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南?？?70100;2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門361021)

花鰻鱺(Anguilla marmorata)為脊索動物門、脊椎動物亞門、硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鰻鱺總目、鰻鱺目、鰻鱺科、鰻鱺屬的一種，又稱鱸鰻，是世界上鰻鱺屬中分布最廣泛的一種［1］，北至韓國濟(jì)州島、東至小笠原群島、南至南太平洋的馬克薩斯群島、西至非洲東海岸的納塔爾均有分布;在我國自錢塘江至海南省各江河水系中都有分布。

花鰻鱺因其市場價格是其他鰻鱺品種的3～5倍，備受養(yǎng)殖者的青睞，盲目的集約化養(yǎng)殖和養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，導(dǎo)致近幾年花鰻鱺養(yǎng)殖病害頻繁發(fā)生，經(jīng)濟(jì)損失慘重。以往關(guān)于花鰻鱺的研究集中在其分類、地理分布、生活習(xí)性、資源調(diào)查等方面［2-6］，而在花鰻鱺病害防治藥物的研究上極少。筆者以自主分離的花鰻鱺致病菌為研究基礎(chǔ)，選擇4種中藥和3種西藥采用瓊脂平板稀釋法，針對分離的3株花鰻鱺致病菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，以期為養(yǎng)殖戶提供科學(xué)、有效的病害防治理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 患病鰻鱺采至海南省?？谑写笾缕禄狑~養(yǎng)殖場，從其內(nèi)臟(肝臟、腎臟、脾臟等)器官分離、純化到3株病原菌，由廈門市集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院協(xié)助，通過生理生化和基因鑒定，3株病原菌分別確定為遲鈍愛德華氏菌(Sh1)、嗜水氣單胞菌(L2b)、威隆氣單胞菌(L2s)。

1.2 試驗(yàn)藥材 中藥:虎杖(Rhizoma polygoni Cuspidati，簡稱 RPC);大黃(Rheum palmatum Linn.，簡稱RPL);五倍子(Rhus chinensis Mill.，簡 稱 RCM);黃 連 (Coptis chinensis Franch，簡稱 CCF)。

西藥:氟苯尼考(Florfenicol)、阿莫西林(Amoxicillin)、強(qiáng)力霉素(Doxycycline hyclate tablets)。

1.3 中藥加工 首先，用中藥粉碎機(jī)粉碎至100目左右，然后放入超微粉碎機(jī)進(jìn)一步粉碎，收集超微藥粉備用。在掃描電子顯微鏡下觀察，90%以上的顆粒粒徑大小為5～10μm。

1.4 菌懸液的制備 將保種的菌液接種于瓊脂平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20～24 h;挑取單個菌落劃線至新鮮斜面上，28℃下培養(yǎng)20～24 h后，用無菌生理鹽水將菌體沖洗下來，使用濁度儀將菌液濃度稀釋至107CFU/ml，即可作為藥敏試驗(yàn)接種的菌懸液。

1.5 中草藥抑菌試驗(yàn) 采用瓊脂稀釋法［7］，以中草藥為溶質(zhì)，以營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為溶劑，配制出2倍濃度梯度的藥敏培養(yǎng)基(除五倍子的稀釋梯度為 0.50、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 和0.007 812 5 mg/L;其他3 種中草藥的稀釋梯度為 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 和 0.125 mg/L)。藥敏培養(yǎng)基均經(jīng)過高壓滅菌后倒平板，取已調(diào)好濃度的菌液2μl接種在含藥平板上，每個藥物梯度做3組平行試驗(yàn)。將接種好的平板放置28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24和48 h。

1.6 西藥抑菌試驗(yàn) 首先用無菌水配置1 mg/ml西藥母液，然后以高壓滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為溶劑，采用二倍稀釋法配制不同濃度梯度的藥敏培養(yǎng)基(濃度梯度為25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 和0.05 μg/L)。取已配制的菌液2μl接種在含藥平板上，每個藥物梯度做3組平行試驗(yàn)。將接種好的平板放置28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24和48 h。

1.7 結(jié)果觀察 以24 h無菌落形成的最低濃度為中藥對該菌株的最低抑菌濃度(MIC)，以48 h藥板上無菌落形成的最低濃度為中藥對該菌株的最低殺菌濃度(MBC)。只有2個平行組的MIC值或MBC值一致時，才能界定為抑菌(殺菌)濃度，否則需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥對3株病原菌的抑制作用 比較了4種中藥對養(yǎng)殖花鰻鱺3株病原菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。由表1可知，五倍子、大黃、黃連、虎杖對3株致病菌均具有一定的抑制效果，且MIC值和MBC值相等或呈雙倍關(guān)系。其中，4種中草藥對Sh1菌株的MIC值:五倍子＜大黃＜黃連＜虎杖;4種中草藥對Sh1菌株的MBC值:五倍子＜大黃＜黃連＜虎杖，五倍子和黃連的MIC值和MBC值相同，大黃和虎杖的MBC值是MIC值的2倍。4種中草藥對L2b菌株的MIC值:五倍子＜大黃＜黃連＜虎杖;4種中草藥對Sh1菌株的MBC值:五倍子＜大黃＜黃連＜虎杖，五倍子、黃連和虎杖的MIC值和MBC值相同，大黃的MBC值是MIC值的2倍。4種中草藥對L2s菌株的MIC值:五倍子＜大黃＜黃連＜虎杖;4種中草藥對Sh1菌株的MBC值:五倍子＜大黃＜黃連＜虎杖，五倍子、大黃和黃連的MIC值和MBC值相同，而虎杖的MBC值是MIC值的2倍。

表1 不同中草藥3株病原菌的MIC和MBC mg/ml

2.2 西藥對3株病原菌的抑制作用 比較了3種西藥對養(yǎng)殖花鰻鱺3株病原菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。由表2可知，氟苯尼考、阿莫西林和強(qiáng)力霉素對3株致病菌均有良好的抗菌活性，其中強(qiáng)力霉素對Sh1菌株的MIC值最小，達(dá)到0.2μg/ml;其次是氟苯尼考、阿莫西林，對Sh1菌株的MIC值分別達(dá)到0.8和6.4μg/ml;阿莫西林和強(qiáng)力霉素的MBC值與MIC值相同，氟苯尼考的MBC值為25.6μg/ml。氟苯尼考對L2b菌株的MIC值最小，小于0.05μg/ml;其次是強(qiáng)力霉素、阿莫西林，對L2b菌株的MIC值分別為0.2和6.4 μg/ml;阿莫西林和強(qiáng)力霉素的MBC值與MIC值相同，氟苯尼考的MBC值與MIC值均小于0.05μg/ml。氟苯尼考對L2s菌株的MIC值最小，小于0.05μg/ml，其次是強(qiáng)力霉素、阿莫西林，對L2b菌株的MIC值分別為0.8和3.2μg/ml;阿莫西林和強(qiáng)力霉素的MBC值與MIC值相同，氟苯尼考的MBC值與MIC值均小于0.05 μg/ml。

表2 不同西藥對3株病原菌的MIC和MBC μg/ml

3 討論與結(jié)論

3.1 中藥對3株花鰻鱺病原菌的抑制作用 中草藥具有天然性、營養(yǎng)性、毒副作用小、無抗藥性等優(yōu)點(diǎn)［8-9］，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的主要作用包括:防治疾病、增強(qiáng)免疫力;促進(jìn)生長，提高飼料利用率;提高存活率;減少應(yīng)激作用，增加動物的耐受力等作用［10-12］。筆者研究了4種中草藥對3株花鰻鱺致病菌的MIC值和MBC值，其平均MIC值大小依次為虎杖＞黃連＞大黃＞五倍子，平均MBC值大小依次為虎杖＞黃連＞大黃＞五倍子。不同中草藥對同一菌株的抑制效果不同，其原因可能是不同中藥草其抑菌成分不同，如五倍子的主要抑菌成分為丙酮提取物［13］;而黃連的主要抑菌成分為小檗堿［14］。另外，各試驗(yàn)組中有些菌株的MIC值和MBC值略有不同，說明中草藥作用于該菌株時，其抑菌濃度和殺菌濃度不同，為今后生產(chǎn)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

3.2 西藥對3株花鰻鱺病原菌的抑制作用 臨床實(shí)踐表明，抗菌西藥對各種細(xì)菌性疾病均有良好的療效。該研究中3種抗菌西藥對3株花鰻鱺病原菌均具有較好的殺菌、抑菌效果，其平均MIC值大小依次為阿莫西林＞強(qiáng)力霉素＞氟苯尼考，平均MBC值大小依次為阿莫西林＞強(qiáng)力霉素＞氟苯尼考。但是，同種抗菌藥對不同菌株抑菌效果有所差異，氟苯尼考對Sh1抑制效果最差(MIC值為0.8μg/ml)，強(qiáng)力霉素對L2s抑制效果最差(MIC值為0.8μg/ml)，而阿莫西林則對Sh1和L2b抑制效果最差(MIC值為6.4μg/ml)。

該研究中4種中草藥和3種西藥對花鰻鱺致病菌均有不同程度的抑菌、殺菌效果，但因抗生素經(jīng)常導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生和水產(chǎn)品藥物殘留等問題［15］，建議在生產(chǎn)實(shí)踐中多使用中草藥或中西藥聯(lián)用，而中西藥聯(lián)用配伍比例有待下一步研究。

［1］李育培，權(quán)衡，盛曉灑，等.花鰻鱺生物學(xué)特性及人工養(yǎng)殖技術(shù)［J］.漁業(yè)致富指南，2008(10):50-52.

［2］袁瑛，閔志勇.花鰻鱺的基礎(chǔ)生物學(xué)研究［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2005(9):29-31.

［3］齊興柱，尹紹武，婁甜甜，等.海南產(chǎn)花鰻鱺細(xì)胞色素b基因的克隆及序列分析［J］.海南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2007(4):397-401.

［4］李育培，權(quán)衡，盛曉灑，等.花鰻鱺的生物學(xué)特性及人工養(yǎng)殖技術(shù)［J］.漁業(yè)致富指南，2008(10):50-52.

［5］朱友芳，林鳳欽，王藝?yán)?，?3個花鰻鱺地理種群的AFLP分析［J］.海洋科學(xué)，2011(8):83-88.

［6］羅鳴鐘，關(guān)瑞章，李忠琴，等.菲律賓花鰻鱺種類鑒別與形態(tài)差異分析［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2012(6):333-338.

［7］葉應(yīng)嫵，王毓三.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程［M］.2版.南京:東南大學(xué)出版社，1997:562-565.

［8］農(nóng)業(yè)部《新編漁藥手冊》編撰委員會.新編漁藥手冊［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2005:317-318.

［9］梁用本.中草藥在防治魚病中的應(yīng)用［J］.漁業(yè)致富指南，2004(18):53.

［10］李順才，杜利強(qiáng)，安瑞永.水產(chǎn)動物中藥添加劑的作用機(jī)理及應(yīng)用概況［J］.水利漁業(yè)，2007，27(6):102-104.

［11］呂欣榮，肖克宇.中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中的應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.內(nèi)陸水產(chǎn)，2007(9):29-31.

［12］溫周瑞，劉慧集，駱敏，等.中草藥對水產(chǎn)動物免疫作用研究進(jìn)展［J］.水利漁業(yè)，2004，24(2):1-3.

［13］王錦文，邊才苗.五味子提取物的抑菌和殺菌活性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(16):6799-6800.

［14］吳蕊，許禮發(fā).中藥制劑對大腸桿菌體外抑殺作用的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)動物防制，2008，24(5):352-354.

［15］萬夕河.水產(chǎn)養(yǎng)殖請慎用抗生素［J］.科學(xué)養(yǎng)魚，2001(4):34.