馬鋼 崔珈銜 任明姬

Caspase-3、Caspase-12與骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的關(guān)系

馬鋼 崔珈銜 任明姬

目的 檢測(cè)Caspase-3, Caspase-12在大鼠骨性關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨中的表達(dá)及相互關(guān)系, 推斷大鼠OA軟骨細(xì)胞凋亡中是否有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的參與。方法 采用Hulth改良法制作大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型, 于造模8周后處死取材觀察大體形態(tài), HE染色觀察軟骨的病理改變, 免疫組織化學(xué)染色和Western blot法檢測(cè)Caspase-3, Caspase-12在軟骨組織中的表達(dá)。結(jié)果 大鼠OA模型側(cè)軟骨外觀表面粗糙、糜爛、潰瘍；HE染色可見(jiàn)軟骨層變薄, 表層軟骨纖維化變性, 中間層軟骨細(xì)胞減少, 深層軟骨細(xì)胞肥大, 甚至變成空泡狀；免疫組織化學(xué)檢測(cè)和Western blot法發(fā)現(xiàn)Caspase-3, Caspase-12表達(dá)較空白對(duì)照側(cè)增高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 大鼠OA的軟骨細(xì)胞Caspase-3, Caspase-12均被激活并調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡；在軟骨細(xì)胞凋亡途徑中, 可能包含ERS介導(dǎo)的通路。

骨性關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；Caspase-3；Caspase- 12

骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種累及膝關(guān)節(jié)的慢性、退行性疾病,在我國(guó)OA患病率高達(dá)9.56%。骨性關(guān)節(jié)炎與軟骨細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［1］, 并且Caspase-3在其中扮演著重要的角色。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是不同于經(jīng)典細(xì)胞凋亡的通路。ERS能影響軟骨細(xì)胞的分化, 抑制軟骨細(xì)胞的合成功能, 但過(guò)度的ERS使細(xì)胞表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白Caspase-12, 介導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)了一個(gè)包括Caspase-12, Caspase-3的特異級(jí)聯(lián)反應(yīng)。其中Caspase-12為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的特異性蛋白, 而Caspase-3為所有凋亡通路的最終執(zhí)行因子。

1 材料與方法

1.1 材料 健康5月齡Wistar大鼠購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心, 兔抗Caspase-3抗體、兔抗β-tubulin抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所, 兔抗Caspase-12抗體購(gòu)自上海生工生物工程有限公司, HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司, DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 OA動(dòng)物模型制作和取材：健康級(jí)大鼠采用Hulth改良法手術(shù)橫斷前交叉韌帶行OA造模, 左側(cè)為空白對(duì)照側(cè)。另選取10只縱行剖開(kāi)脛骨及股骨, 立即投入100 ml/L中性福爾馬林液, 固定, 脫鈣, 浸蠟, 包埋, 制備蠟塊, 供HE染色及免疫組織化學(xué)染色使用。

1.2.2 HE染色觀察關(guān)節(jié)病變：按常規(guī)進(jìn)行HE染色, 光鏡下觀察軟骨層結(jié)構(gòu), 細(xì)胞的排列及基質(zhì)染色。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色觀察Caspase-3, Caspase-12的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)SABC法。軟骨細(xì)胞中胞質(zhì)染色成棕黃色顆粒的細(xì)胞即為陽(yáng)性, 并進(jìn)行平均吸光度(A)值分析, 吸光度值與陽(yáng)性表達(dá)程度成反比。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)Caspase-3, Caspase-12的表達(dá)參照文獻(xiàn)［6］選取每例樣品, 進(jìn)行分離, 濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,封閉等操作, 用Caspase-3、Caspase-12的A值與β-Tubulin的A值相比表示其表達(dá)的相對(duì)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)觀察及評(píng)分 軟骨標(biāo)本大體結(jié)構(gòu)觀察顯示?？瞻讓?duì)照側(cè)膝軟骨光滑呈半透明乳白色, 模型側(cè)軟骨表面粗糙、糜爛、潰瘍。

2.2 軟骨組織的組織病理學(xué)觀察 光鏡下觀察顯示：空白對(duì)照側(cè)表層細(xì)胞較小, 其長(zhǎng)軸平行于軟骨表面呈密集排列,中間層細(xì)胞可見(jiàn)“背靠背”雙細(xì)胞分布, 深層軟骨細(xì)胞肥大呈團(tuán)分布；模型側(cè)軟骨層變薄, 表層軟骨細(xì)胞稀疏甚至纖維化變性, 中間層軟骨細(xì)胞減少, 深層軟骨細(xì)胞肥大, 變成空泡狀。

2.3 免疫組化檢測(cè)Caspase-3、Caspase-12的表達(dá)

2.3.1 Caspase-3在膝OA軟骨組織中的表達(dá) 空白對(duì)照側(cè)軟骨細(xì)胞Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)較少, 位于表層, 少見(jiàn)于中間層, 表達(dá)的A值(168.30±5.90)；模型側(cè)軟骨細(xì)胞全層均有Caspase-3較強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá), A值(99.05±7.65), 與空白對(duì)照側(cè)比較, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3.2 Caspase-12在膝OA軟骨組織的表達(dá) 空白對(duì)照側(cè)軟骨表層偶見(jiàn)Caspase-12陽(yáng)性表達(dá), 表達(dá)的A值(173.75±6.56)；模型側(cè)軟骨細(xì)胞表層剝脫, 中間層Caspase-12陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng), A值(115.50±6.31)；與空白對(duì)照側(cè)比較, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 Western blot法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-12蛋白的表達(dá)

空白對(duì)照側(cè)、模型側(cè)軟骨細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-12蛋白的表達(dá), 模型側(cè)表達(dá)明顯高于空白對(duì)照側(cè), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

本研究采用免疫組化及Western blot法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-12的陽(yáng)性表達(dá)及變化規(guī)律, 結(jié)果顯示在大鼠OA模型側(cè)關(guān)節(jié)軟骨組織中, Caspase-3、Caspase-12的陽(yáng)性表達(dá)及蛋白表達(dá)均高于空白對(duì)照側(cè), 提示在OA的軟骨組織中Caspase-3、Caspase-12均被激活, 并參與調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡?？瞻讓?duì)照側(cè)中Caspase-12表達(dá)極低, 可能在沒(méi)有異常理化因素刺激的情況下, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路可能存在于正常的細(xì)胞衰老及凋亡中。Cheung等研究發(fā)現(xiàn), Caspase-12缺陷小鼠對(duì)ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性下降, 但對(duì)其他死亡刺激仍然敏感。證明Caspase-12是ERS激活的, 而非死亡受體或線(xiàn)粒體所介導(dǎo)的凋亡傳導(dǎo)信號(hào)激活的。這種凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑最終會(huì)導(dǎo)致Caspase-3活化, 提示ERS最后被傳到線(xiàn)粒體, 線(xiàn)粒體有可能在這種死亡途徑中起綜合和放大的作用［2］。

綜上所述, 大鼠OA的軟骨細(xì)胞Caspase-3, Caspase-12均被激活并調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡；在軟骨細(xì)胞凋亡途徑中, 可能包含ERS介導(dǎo)的通路。

［1］ 周景輝, 吳耀持, 李石勝, 等.鼠類(lèi)膝骨關(guān)節(jié)炎模型的評(píng)價(jià).中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2010, 14(33):6206-6209.

［2］ Tormanen-Napankangas U, Soini Y, Kahios K, et al.Expression of Caspases-3, -6 and -8 and their relation to apoptosis in non-small cell lung carcinoma.Int J Cancer, 2001, 93(2):192-198.

2014-08-04］

010010 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科(馬鋼),臨床醫(yī)學(xué)部(崔珈銜), 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室(任明姬)

任明姬