， ，卓然， ， (南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

·臨床醫(yī)學(xué)·

紡錘體檢查點(diǎn)蛋白Cenp-E在肝癌組織的表達(dá)及臨床意義

劉斌，劉婧，劉卓然，汪翼，吳廣
(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的觀察紡錘體檢查點(diǎn)蛋白(Cenp-E)在肝癌組織和人類正常肝組織表達(dá)水平的差異，以探討Cenp-E蛋白在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義。方法用熒光定量PCR和Western blot分別檢測(cè)Cenp-E基因和蛋白在肝癌組織和正常肝組織的表達(dá)水平。結(jié)果正常肝組織中Cenp-E基因mRNA水平(0.023 78±0.009 73)明顯高于肝癌組織(0.014 58±0.008 73)；Cenp-E蛋白表達(dá)量在正常肝組織中(0.656±0.012)明顯高于在肝癌組織中的表達(dá)(0.301±0.009)，且二者有顯著性差異。結(jié)論Cenp-E低表達(dá)在肝癌的發(fā)生過(guò)程中起重要作用。

紡錘體檢查點(diǎn)； Cenp-E基因； 肝癌

肝細(xì)胞癌(human hepatocellular carcinoma，HCC)是十大惡性腫瘤之一,發(fā)生機(jī)制仍不十分清楚。研究證實(shí),HCC存在基因組不穩(wěn)定性或遺傳學(xué)不穩(wěn)定性。應(yīng)用比較基因組雜交(CGH)技術(shù)對(duì)50例的HCC基因組圖譜進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)DNA缺失普遍存在于4q(70%)、8p(65%)、17p(51%)、13q(37%)、6p(37%)和1p(30%)；而DNA增縊頻繁發(fā)生在8q(60%)、1q(58%)、6p(30%)和17q(30%),表明在HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在多種染色體的異常[1]。以上表明HCC的發(fā)生是一種多染色體，多基因異常的結(jié)果。但具體涉及哪些基因以及他們?cè)诎┳冞^(guò)程中所起的作用尚有待進(jìn)一步研究。

紡錘體檢查點(diǎn)(spindle checkpoint，SCP)的功能是監(jiān)測(cè)細(xì)胞染色體分離。檢查點(diǎn)功能喪失的一個(gè)后果是遺傳不穩(wěn)定性,促使細(xì)胞更容易惡變。由此可見(jiàn)由于紡錘體檢查點(diǎn)在有絲分裂中負(fù)責(zé)監(jiān)督染色體排位和分離,它們的結(jié)構(gòu)改變和組分喪失也可以引發(fā)一些癌癥[2]。有報(bào)道SCP另一個(gè)重要基因有絲分裂阻滯缺陷蛋白2(MAD2)在乳腺癌中蛋白表達(dá)是降低的[3]。本研究探討紡錘體檢查點(diǎn)蛋白Cemp-E在肝癌組織的表達(dá)情況，為肝癌的臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

收集2012年1月～2013年10月南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院和南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝癌患者術(shù)中肝癌組織及癌旁正常肝組織21例。術(shù)前經(jīng)患者及家屬同意,并通過(guò)南華大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。DNA及質(zhì)粒抽提試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自上海華舜公司。Cenp-E和GAPDH的兔一抗，羊抗兔二抗購(gòu)自Santa-Cruz公司。SYBR Green染料熒光定量試劑購(gòu)自Takara公司。RIPA裂解液購(gòu)自上海申能博彩。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 將肝癌組織及癌旁正常組織按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作用Trizol試劑(GIBICO公司)提取總RNA。然后按照Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物鑒定 引物序列由Takara公司設(shè)計(jì)并合成,Cenp-E基因上游引物：5′-GCTGTCTGCGATACTGTGAAC-3′；下游引物：5′-CAATCCCTCCAAAATCAAGTG-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GCAGAGGGGGCAGAGATGA-3′，下游引物：5′-ACTCCTCTGGCTTCTCTGGTT-3′。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 15 s，63 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃退火延伸10 min；PCR產(chǎn)物4 ℃保存。

1.2.3 T-A克隆 將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,按照華舜膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)純化PCR產(chǎn)物,按照Takara操作說(shuō)明書(shū)將其連接到pMD18-T質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)菌中，鋪板挑陽(yáng)性菌落做菌落PCR，初步鑒定為陽(yáng)性者增菌提質(zhì)粒送公司測(cè)序，經(jīng)DNAssist Versuib 1.02軟件比對(duì)后制備純化質(zhì)粒用于定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

1.3 熒光定量PCR

用SYBR Green染料熒光定量法(Takara公司的試劑)檢測(cè)Cenp-E基因的mRNA的水平，Cenp-E基因與內(nèi)參引物見(jiàn)前。用已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 10 s 1個(gè)循環(huán) ；95 ℃ 5 s，63 ℃ 31 s 40個(gè)循環(huán)。

1.4 Western blot免疫印跡

1.4.1 蛋白質(zhì)抽提和定量(參照試劑說(shuō)明)，步驟如下 (1)每100 mg組織加入400 μL RIPA裂解液和4 μL PMSF。放入勻漿器中于冰上研磨。

(2)移至1.5 mL Ep管，冰上放置30 min后，4 ℃ 13 000 rpm離心30 min。

(3)收集上清即為蛋白液，分裝為50 μL每管于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測(cè)定.

1.4.2 Western blot檢測(cè)Cenp-E蛋白的表達(dá) 將肝癌組織，提出的蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜．兔一抗的釋度為1∶200；羊抗兔二抗皆作1∶5 000稀釋;ECL法顯色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù),結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組內(nèi)比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05差異有顯著性。

2.1 Cenp-E基因mRNA水平分析

熒光定量PCR檢測(cè)Cenp-E基因在各組的mRNA水平，溶解曲線如圖1所示，以Cenp-E基因mRNA拷貝數(shù)/GAPDH基因mRNA拷貝數(shù)的均值作為該樣品中Cenp-E基因表達(dá)水平，在正常肝組織中表達(dá)水平(0.023 78±0.009 73)高于肝癌組織(0.014 58±0.008 73),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 肝癌組織Cenp-E蛋白表達(dá)

Cenp-E蛋白表達(dá)如圖2所示，可以發(fā)現(xiàn)Cenp-E與GAPDH的灰度值比值在正常肝組織中為0.656±0.012,在肝癌組織中為0.301±0.009.P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=21)。

3 討 論

Cenp-E主要定位于著絲粒的外層,是一種重要著絲粒特異蛋白，同時(shí)也是著絲粒點(diǎn)與微管有效連接的動(dòng)力蛋白。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明Cenp-E在SCP機(jī)制起著非常重要的作用，現(xiàn)在研究表明，一定量的Cenp-E水平，對(duì)SCP的激活是起非常重要的作用[4]。Cenp-E主要通過(guò)BubR1來(lái)影響SCP機(jī)制，當(dāng)Cenp-E與BubR1作用時(shí)，通過(guò)一系列的分子反應(yīng)后，MAD2開(kāi)始從著絲粒脫落，姐妹染色單體開(kāi)始分離，從而導(dǎo)致細(xì)胞分裂開(kāi)始[5]。

圖2 Cenp-E蛋白表達(dá). 1：正常肝組織；2：肝癌組織. 與正常肝組織相比，*：P<0.05

另外研究發(fā)現(xiàn)在許多癌細(xì)胞有異常的SCP功能。MAD2表達(dá)降低見(jiàn)于鼻咽癌、肝細(xì)胞癌、人乳腺癌及其一些乳腺癌細(xì)胞系和卵巢癌等，并與SCP缺陷切相關(guān)[6]。Bubl是SCP中另外一種較重要的癌基因，Bubl的mRNA降低也見(jiàn)于結(jié)腸癌和急性粒細(xì)胞性白血病[7]，高水平Bubl、BubR1和Bub3表達(dá)也與胃癌細(xì)胞增殖能力密切相關(guān)[8]。但Cenp-E與腫瘤之間的關(guān)系還不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)Cenp-E在正常肝組織中表達(dá)明顯高于肝癌組織，肝癌組織中Cenp-E蛋白表達(dá)的降低引起的紡錘體檢查點(diǎn)監(jiān)控功能下降，很可能是導(dǎo)致肝癌細(xì)胞有絲分裂失控并導(dǎo)致染色體數(shù)目紊亂的重要原因之一。我們推測(cè)肝癌組織Cenp-E表達(dá)水平的不足可能是引起紡錘體檢查點(diǎn)的功能異常的重要原因之一，最終導(dǎo)致細(xì)胞分裂失控和染色體數(shù)目異常以及腫瘤細(xì)胞的發(fā)生。

由于組織標(biāo)本包含細(xì)胞的復(fù)雜性和不純性，本研究只能大致從量上分析肝癌和正常組織Cenp-E的表達(dá)差異。進(jìn)一步在肝癌細(xì)胞系和正常細(xì)胞系中研究Cenp-E的功能，將為進(jìn)一步探明肝癌的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為肝癌臨床早期預(yù)防及診斷治療提供新的依據(jù)。

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ExpressionoftheSpindleCheckpointProteinCenp-EintheHumanHepatomTissueandItsClinicalSignificance

LIU Bin,LIU Jing,LIU Zhuoran,et al
(Clinicallaboratory,thesecondaffiliatedhospital,universityofsouthchina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo study the differential expression and its clinical significance of the spindle checkpoint protein Cenp-E gene between the human hepatoma and hepatic tissue.MethodsReal-time fluorescent-quantitation PCR and Western blot were employed to detect the expressions of the Cenp-E mRNA and protein,respectively.ResultsThe expression of the Cenp-E mRNA in human hepatic tissue(0.023 78±0.009 73) was higher than that in human hepatoma tissue(0.014 58±0.008 73).The expression of the Cenp-E protein in human hepatic tissue(0.656±0.012) was higher than that in human hepatoma tissue(0.301±0.009).ConclusionCenp-E gene low expression in human hepatocellular carcinoma plays an important role in the its developmental process.

spindle checkpoint; Cenp-E gene; hepatoma

2095-1116(2014)05-0459-03

2014-01-17

湖南省教育廳課題(No.13C796).

劉斌 ,碩士，主管技師，研究方向：腫瘤細(xì)胞周期和染色體分裂機(jī)制，E-mail: 29869248@.qq.com.

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(此文編輯：秦旭平)