劉 洋， 杜 明， 張根義

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

復(fù)雜的自然界中經(jīng)常會(huì)有不同類型的真菌毒素共同存在，人們?cè)谏钪杏锌赡芡瑫r(shí)接觸2種甚至2種以上的毒素，不同毒素共存時(shí)對(duì)機(jī)體的聯(lián)合毒性作用引起了人們的廣泛研究。M.J.Ruiz研究了白僵菌素（BEA）、嘔吐毒素（DON）和 T-2毒素在CHO-K1細(xì)胞中的聯(lián)合作用，其中BEA和T-2毒素為協(xié)同作用，DON與BEA、T-2均顯示為拮抗作用[1]；熊麗林求得微囊藻毒素和黃曲霉毒素及伏馬菌素的聯(lián)合作用類型為加和作用[2]。

黃曲霉毒素 B1（Aflatoxin B1，簡(jiǎn)稱 AFB1）是目前已知的毒性較強(qiáng)的真菌毒素，它可以導(dǎo)致誘發(fā)性肝癌的產(chǎn)生。有關(guān)黃曲霉毒素在不同劑量下單獨(dú)作用于多種細(xì)胞的急慢性毒性已有很多報(bào)道，但關(guān)于黃曲霉毒素與其它毒素的聯(lián)合作用的毒性研究較少。雜色曲霉素（Sterigmatocystin，簡(jiǎn)稱ST）由10多種真菌代謝產(chǎn)生，是一種含有呋喃環(huán)的氧雜蒽酮類化合物，已知被ST污染的食品包括大米、小麥、玉米、花生、大豆、火腿、奶酪、咖啡等，而黃曲霉毒素AFB1也廣泛存在于各種谷物和飼料中，它們共存的可能性非常高。為此選取了黃曲霉毒素B1和雜色曲霉素進(jìn)行聯(lián)合毒性的研究。AFB1的主要靶器官是肝臟，同時(shí)ST在肝內(nèi)會(huì)轉(zhuǎn)化成1，2-環(huán)氧ST，該物質(zhì)會(huì)與DNA形成加合物，這極有可能是ST導(dǎo)致肝癌發(fā)生的機(jī)制[3]，因此肝臟是 AFB1和 ST共同的主要靶器官。

HepG2細(xì)胞來(lái)源于人肝胚細(xì)胞瘤，分化程度較高[4]，并且其所含的生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有同源性，其中肝細(xì)胞色素P450是主要參與體內(nèi)藥物代謝的酶系[5]，對(duì)許多內(nèi)源性、外源性化合物在體內(nèi)Ⅰ相生物轉(zhuǎn)化有重要作用，許多藥物通過(guò)P450酶的調(diào)控作用來(lái)影響其活性，因而選擇HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，來(lái)研究AFB1和ST的聯(lián)合毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2人肝癌細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、無(wú)酚紅HBSS，Gibco公司提供；雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品（ST）、黃曲霉B1標(biāo) 準(zhǔn) 品 （AFB1）、SRB、TCA、H33258、Tris base、小 牛胸腺 DNA、DCFH-DA、DCF、羅丹明 123，Sigma公司提供；ATP檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)公司提供；Infinite 1000酶標(biāo)儀，Tecan公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒

HepG2細(xì)胞用內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培育至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[6]。用DMSO溶解AFB1、ST制成母液，再用DMEM培養(yǎng)基稀釋1 000倍至DMSO終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的儲(chǔ)備液。用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%DMSO溶液的DMEM培養(yǎng)基將儲(chǔ)備液配制為所需濃度的工作液。

1.3 細(xì)胞毒性測(cè)定方法

1.3.1 SRB法測(cè)定AFB1、ST對(duì)HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度 調(diào)整對(duì)數(shù)期細(xì)胞密度為3×104個(gè)/mL，每孔200 μL接種于96孔板中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含AFB1或者ST的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入4℃預(yù)冷的三氯乙酸（TCA）溶液，4℃固定1 h，去離子水洗4～5次，風(fēng)干后每孔加入4 g/L SRB溶液，室溫下孵育30 min，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%乙酸洗4～5次，風(fēng)干后每孔加入10 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.4），搖動(dòng)混勻，震蕩5 min后在490 nm下測(cè)定吸光度A（下標(biāo)g、k、d分別表示給藥組、空白組、對(duì)照組）。計(jì)算不同時(shí)間、不同濃度的真菌毒素對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率。增殖抑制率

Y=[1-（Ag-Ak）/（Ad-Ak）]×100%。

其中 AFB1染毒濃度為 0 （溶劑對(duì)照）、1、5、10、50、100 μmol/L，ST 染毒濃度為 0（溶劑對(duì)照）、0.1、1、5、10、14 μmol/L，溶劑對(duì)照組為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%DMSO的DMEM培養(yǎng)基，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組4個(gè)重復(fù)。

1.3.2 AFB1和ST對(duì)HepG2細(xì)胞各部位損傷的檢測(cè) 設(shè)置染毒劑量時(shí)使大部分細(xì)胞處于染毒未致死的狀態(tài)，其中AFB1染毒濃度為0（溶劑對(duì)照）、0.5、1、5、10 μmol/L；ST 染毒濃度為 0 （溶劑對(duì)照）、0.5、2.5、5、7 μmol/L；聯(lián)合染毒組設(shè)置為 0（溶劑對(duì)照），AFB1（10 μmol/L）+ST（濃度設(shè)置與單獨(dú)染毒組相同），ST（5 μmol/L）+AFB1（濃度設(shè)置與單獨(dú)染毒組相同）；對(duì)照組為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%DMSO的DMEM培養(yǎng)基，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組4個(gè)重復(fù)[2]。

1）SRB法測(cè)定細(xì)胞增殖力的變化：操作步驟同1.3.1。

2）細(xì)胞內(nèi)總DNA含量的測(cè)定：調(diào)整對(duì)數(shù)期細(xì)胞密度為 5×104個(gè)/mL，每孔 200 μL接種于 96孔板中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含AFB1或者ST的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。染毒24 h或48 h后，棄培養(yǎng)基，37℃預(yù)熱的HBSS洗一遍，將96孔板置于-80℃的冰箱中冷凍1 h，然后置于37℃水浴鍋中加熱30 min，在所有樣品孔、對(duì)照孔和空白孔中加入100 μL去離子水，再放入-80℃冰箱中冷凍1 h，37 ℃加熱 30 min后，每孔加入 100 μL 5 mg/mL的H33258染料，同時(shí)繪制小牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。室溫下避光靜置30 min后用熒光酶標(biāo)儀測(cè)各孔的熒光值[7]。

3）細(xì)胞內(nèi)ATP含量的測(cè)定：調(diào)整對(duì)數(shù)期細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，每孔200 μL接種于96孔板中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含AFB1或者ST的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。染毒24 h或48 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入20 μL ATP裂解液（冰上操作），反復(fù)吹打使細(xì)胞完全裂解，每孔加180 μL PBS將裂解液洗出，12 000 g離心10 min后，取100 μL上清液，加入預(yù)先加有100 μL ATP檢測(cè)工作液的底部透明板中，迅速混勻后，立即用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出加藥組細(xì)胞內(nèi)ATP濃度。

4）細(xì)胞內(nèi)線粒體通透性的轉(zhuǎn)換：調(diào)整對(duì)數(shù)期細(xì)胞密度為 5×104個(gè)/mL，每孔 200 μL接種于 96孔板中孵育24 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入5 μg/mL羅丹明123工作液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%CO237℃孵育30 min后，1 000 r/min離心10 min，用培養(yǎng)基洗一遍，相同條件離心后加入含AFB1或者ST的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出加藥組細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到的羅丹明123含量，判斷細(xì)胞內(nèi)線粒體通透性的改變。

5）細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的測(cè)定：調(diào)整對(duì)數(shù)期細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，每孔200 μL接種于96孔板中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的PBS洗一遍后，加入37℃預(yù)熱的DCFH-DA探針（終濃度為10 μmol/L，溶解于DMEM中），37℃避光孵育30 min后，1 000 r/min離心10 min，將探針吸除，加入DMEM清洗探針，再1 000 r/min離心10 min，吸除DMEM后將各孔換為含AFB1或者ST的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，采用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)二氯熒光黃（DCF）的熒光強(qiáng)度[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s進(jìn)行表示，使用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用origin18.1軟件繪圖。用Probit analysis算出各毒素的IC50[9]。ST與AFB1混合物對(duì)HepG2聯(lián)合毒性作用類型采用成對(duì)樣本T檢驗(yàn)“預(yù)測(cè)值”和“測(cè)量值”之間的顯著性差異，若P＞0.05，表示兩組數(shù)據(jù)無(wú)顯著性差異，反映AFB1與ST的聯(lián)合毒性為加和作用[10]。其中，“預(yù)測(cè)值”為AFB1或ST的固定濃度產(chǎn)生的效應(yīng)值與另一種毒素的各濃度梯度單獨(dú)作用于細(xì)胞分別產(chǎn)生的效應(yīng)值的相加值；“測(cè)量值”為兩種毒素以不同濃度混合后實(shí)際測(cè)得毒素對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)值。5個(gè)毒性作用終點(diǎn)采用主成分分析法（PCA）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1、ST對(duì)HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度

AFB1和ST對(duì)HepG2細(xì)胞增殖力的抑制率呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)中染毒濃度對(duì)應(yīng)的細(xì)胞增殖力抑制率，使用SPSS進(jìn)行Probit analysis分析，概率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度即為該毒素對(duì)HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。兩種毒素對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50如表1所示。從表1可看出，ST的 IC50要比AFB1的IC50低50%，說(shuō)明ST對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性高于AFB1的毒性。

2.2 AFB1、ST單獨(dú)作用及聯(lián)合作用對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞增殖力影響

AFB1、ST對(duì)細(xì)胞的毒性作用在24 h時(shí)并沒(méi)有明顯的趨勢(shì)，48 h時(shí)細(xì)胞增殖力的降低程度基本呈現(xiàn)毒素劑量相關(guān)性。如圖1所示，細(xì)胞染毒48 h后，與對(duì)照組（100%）相比，單獨(dú)作用時(shí)AFB1濃度在0.5～10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖力抑制率為 6.28%～43.59%， 呈指數(shù)型下降；ST濃度在 0.5～7 μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖力抑制率為24.32%～49.5%，呈線性下降；聯(lián)合作用時(shí)，ST+AFB1（10 μmol/L）混合組中，ST濃度為0.5 μmol/L時(shí)的抑制率為45.39%，同單獨(dú)作用時(shí)ST的最大濃度即7 μmol/L的抑制率基本一致。并且從圖1（b）可以看出，AFB1+ST混合組的抑制率均高于單獨(dú)作用組，其中 ST（5 μmol/L）+AFB1混合組的細(xì)胞增殖力呈指數(shù)型下降，ST+AFB1（10 μmol/L）混合組的增殖力呈線性下降，可以看出兩種毒素混合后并不會(huì)影響毒素自身對(duì)細(xì)胞增殖力抑制作用的變化規(guī)律。

表 1 AFB1、ST 對(duì) HepG2的 IC50Table 1 IC50determinations of AFB1and ST in HepG2 by probit analysis

圖1 AFB1和ST對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞增殖力的影響（48 h）Fig.1 Inhibition rate of AFB1and ST in HepG2（48 h）

2.3 AFB1、ST單獨(dú)作用及聯(lián)合作用對(duì)HepG2細(xì)胞DNA含量的影響

細(xì)胞在96孔板中經(jīng)過(guò)兩次凍融循環(huán)被破壞并釋放DNA，而H33258與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)由非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為高熒光物質(zhì)，反映了細(xì)胞中總DNA的含量。AFB1、ST對(duì)細(xì)胞DNA含量的影響在24 h時(shí)并不明顯，48 h時(shí)DNA含量的降低程度基本呈現(xiàn)毒素劑量相關(guān)性。如圖2所示，細(xì)胞染毒48 h后，與對(duì)照組 （100%）相比，單獨(dú)作用時(shí)AFB1濃度在0.5～10 μmol/L 時(shí)，DNA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（相對(duì)質(zhì)量）下降為110.55%～55.21%，呈對(duì)數(shù)型下降；ST濃度在0.5～7 μmol/L時(shí)，DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降為 116.27%～76.89%，下降趨勢(shì)可用乘冪回歸表示；實(shí)驗(yàn)結(jié)果中細(xì)胞DNA含量在低劑量組中出現(xiàn)了高于對(duì)照組DNA含量的現(xiàn)象，可能由于低劑量的毒素未對(duì)細(xì)胞造成損傷，反而引起細(xì)胞內(nèi)的抵抗反應(yīng)，合成了較多的DNA，從而高出對(duì)照組的含量。聯(lián)合作用時(shí)，ST（5 μmol/L）+AFB1混合組中，AFB1濃度為 0.5 μmol/L時(shí)的DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降為54.72%，同單獨(dú)作用時(shí)AFB1的最大濃度即10 μmol/L時(shí)的DNA含量基本一致。

圖2 AFB1和ST對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)DNA含量的影響（48 h）Fig.2 Effect of AFB1and ST on DNA content in HepG2 cells（48 h）

從圖2（b）可以看出，AFB1+ST混合組的DNA減少量均高于單獨(dú)組，其中 ST（5 μmol/L）+AFB1混合組的細(xì)胞增殖力呈對(duì)數(shù)型下降，ST+AFB1（10 μmol/L）混合組的增殖力的下降趨勢(shì)可用乘冪回歸表示，可以看出毒素在單獨(dú)作用和聯(lián)合作用時(shí)，并不會(huì)因?yàn)榱硗庖环N毒素的混合而影響其本身對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

2.4 AFB1、ST單獨(dú)作用及聯(lián)合作用對(duì)HepG2細(xì)胞ATP水平的影響

細(xì)胞ATP水平在24 h時(shí)已基本呈現(xiàn)毒素劑量相關(guān)性，48 h時(shí)ATP含量的降低程度更加明顯。如圖3所示，細(xì)胞染毒24 h后，與對(duì)照組（100%）相比，AFB1濃度在 0.5～10 μmol/L 時(shí)，單獨(dú)作用及聯(lián)合作用時(shí)ATP含量呈線性下降；而ST單獨(dú)作用濃度在 0.5～7 μmol/L時(shí)，ATP摩爾分?jǐn)?shù)（相對(duì)物質(zhì)的量）下降為42.30%～22.21%，為乘冪型下降，與AFB1聯(lián)合作用后同樣呈乘冪型下降。ATP是5個(gè)毒性作用終點(diǎn)中最早對(duì)毒素產(chǎn)生顯著反應(yīng)的指標(biāo)，較早的反應(yīng)細(xì)胞的染毒狀態(tài)可以作為細(xì)胞染毒的早期檢測(cè)指標(biāo)。

圖3 AFB1和ST對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響（24 h）Fig.3 Effect of AFB1and ST on ATP content in HepG2 cells（24 h）

2.5 AFB1、ST單獨(dú)作用及聯(lián)合作用對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體通透性的影響

羅丹明123在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，熒光強(qiáng)度減弱或消失。而在凋亡發(fā)生時(shí)，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放，引起線粒體跨膜電位（ΔΨm）的崩潰，羅丹明123重新釋放出線粒體，發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光。通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，檢測(cè)線粒體膜電位的變化和凋亡的發(fā)生。如圖4所示，細(xì)胞染毒48 h后，隨著AFB1和ST濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的含量有上升的趨勢(shì)，但上升的程度并不明顯，但從圖4（b）可看出，AFB1和ST混合組中羅丹明123的含量增長(zhǎng)率均明顯高于單獨(dú)作用組。

圖4 AFB1和ST對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)線粒體膜通透性的影響（48 h）Fig.4 Effect of AFB1and ST on mitochondrial membrane permeability in HepG2 cells（48 h）

2.6 AFB1、ST單獨(dú)作用及聯(lián)合作用對(duì)HepG2細(xì)胞活性氧水平的影響

細(xì)胞中二氯熒光黃（DCF）的熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞中活性氧的含量。染毒24 h后細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生并不明顯，48 h時(shí)細(xì)胞活性氧含量的增加基本呈現(xiàn)毒素劑量相關(guān)性，如圖5所示。

圖5 AFB1和ST對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的影響（48 h）Fig.5 Effect of AFB1and ST on reactive oxygen in HepG2 cells（48 h）

細(xì)胞染毒48 h后，與對(duì)照組（100%）相比，單獨(dú)作用時(shí)AFB1濃度在0.5～10 μmol/L時(shí)，活性氧摩爾分?jǐn)?shù)（相對(duì)物質(zhì)的量）上升為99.50%～115.29%；ST濃度在0.5～7 μmol/L時(shí)，活性氧摩爾分?jǐn)?shù)上升為106.28%～116.27%； 聯(lián)合作用時(shí)，ST （5 μmol/L）+AFB1混合組中，AFB1濃度為1 μmol/L時(shí)的ROS的摩爾分?jǐn)?shù)值為102%，同單獨(dú)作用時(shí)AFB1濃度為5 μmol/L的ROS含量基本一致。通過(guò)擬合，AFB1和ST在單獨(dú)作用和聯(lián)合作用時(shí)均呈指數(shù)型下降，并且從圖5（b）可以看出，AFB1+ST混合組的活性氧增加量均大于單獨(dú)作用組，可以得出兩種毒素混合后對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用有所增強(qiáng)。

2.7 AFB1與ST混合物對(duì)HepG2細(xì)胞的聯(lián)合毒性作用

5個(gè)毒性作用終點(diǎn)的測(cè)量值與預(yù)測(cè)值的顯著性分析如表2所示，細(xì)胞增殖力、ATP含量、DNA含量、ROS含量及線粒體膜電位的測(cè)量值與預(yù)測(cè)值之間均無(wú)顯著性差異，表明AFB1和ST對(duì)HepG2的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為加和作用。

表2 成對(duì)樣本T檢驗(yàn)分析混合物的測(cè)量值及預(yù)測(cè)值差異性Table 2 Principal component analysis of five endpoints

2.8 AFB1和ST對(duì)HepG2細(xì)胞的5個(gè)作用終點(diǎn)的主成分分析

AFB1及ST對(duì)HepG2細(xì)胞48 h毒性作用的PCA分析如表3所示。

根據(jù)各個(gè)作用終點(diǎn)在2個(gè)成分中的系數(shù)，AFB1和ST對(duì)HepG2細(xì)胞的單獨(dú)作用及聯(lián)合作用終點(diǎn)均可分為3類：細(xì)胞增殖力；ATP含量、DNA含量；活性氧含量（ROS）和線粒體膜通透性（MMP）。根據(jù)主成分分析分類結(jié)果，ROS的產(chǎn)生與線粒體膜通透性的下降反映了兩種毒素對(duì)細(xì)胞的同一損傷效應(yīng)。因線粒體受損后產(chǎn)生活性氧，進(jìn)一步對(duì)線粒體氧化損傷，故深入研究時(shí)，可根據(jù)分類結(jié)果選取每類中的一個(gè)指標(biāo)進(jìn)行毒素對(duì)細(xì)胞的毒性作用檢測(cè)。

表3 AFB1及ST對(duì)HepG2毒性5個(gè)作用終點(diǎn)的主成分分析Table 3 Principal component analysis of five endpoints

3 討論

首次得出雜色曲霉素ST在HepG2細(xì)胞中的IC50值；并且以HepG2細(xì)胞為對(duì)象，以5個(gè)毒性作用終點(diǎn)為依據(jù)，研究了AFB1和ST兩種真菌毒素的聯(lián)合作用類型，經(jīng)分析推斷其聯(lián)合毒性作用類型為加和作用。本實(shí)驗(yàn)中5個(gè)毒性終點(diǎn)從不同方面檢驗(yàn)了AFB1和ST對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞受到毒素刺激后，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的下降會(huì)伴隨著ATP水平的下降，同時(shí)線粒體是活性氧產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，又是活性氧作用最敏感的部位，活性氧會(huì)對(duì)線粒體造成氧化損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。5個(gè)毒性作用終點(diǎn)的主成分分析得知，單獨(dú)作用及聯(lián)合作用均具有共同的主成分，推測(cè)可能由于黃曲霉毒素B1與雜色曲霉素對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用位點(diǎn)基本一致，并且具有相似的信號(hào)代謝通路，使其聯(lián)合作用的類型為加和作用。

4 結(jié)語(yǔ)

此次研究雖然僅從細(xì)胞水平對(duì)2種毒素的聯(lián)合作用類型進(jìn)行判斷，但采用的多指標(biāo)驗(yàn)證方法為多種真菌毒素聯(lián)合作用的深入研究提供了參考。對(duì)于食品中真菌毒素的最大允許量，國(guó)家有明確的規(guī)定[12]，但規(guī)定中沒(méi)有提及兩種以上的真菌毒素共同存在時(shí)的限量標(biāo)準(zhǔn)，所以當(dāng)兩種以上毒素共存時(shí)，其含量分別符合限量標(biāo)準(zhǔn)，但如果其聯(lián)合加和或協(xié)同作用，則會(huì)對(duì)人體造成更大傷害。因此，通過(guò)研究食品中常見(jiàn)的真菌毒素共存時(shí)的聯(lián)合作用，可為食品安全提供更準(zhǔn)確的理論依據(jù)。

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