西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內科（西安710061） 邵 靚 張 萍 張 勇 馬愛群

急性心肌缺血再灌注損傷是急性心肌梗死患者接受再灌注治療后的嚴重不良后果，直接導致患者心功能降低和預后不良。目前研究認為：急性心肌缺血再灌注后的心臟舒縮功能障礙可能由多種原因引起，如血栓脫落栓塞［1］，心肌抑頓［2］，內皮細胞水腫［3］，微血管痙攣外［4］，炎癥因子作用和原位血栓形成。然而急性心肌缺血再灌注后心功能的惡化不僅僅單純是由于心肌細胞的損傷、凋亡及壞死所導致，心肌間質明顯的改變也會對心功能造成較大的影響。

心肌細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）的主要成分是心肌成纖維細胞分泌的膠原纖維，對維持心臟正常形態(tài)和功能起重要作用。在健康心臟中，多種生長因子和細胞因子控制著ECM的合成與降解，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、轉化生長因子β1、白介素和內皮素等。然而在缺血缺氧、高壓力負荷狀態(tài)下，這些調節(jié)的失衡，將會引起ECM合成增加和（或）降解減少，從而導致心肌間質重構、心肌纖維化。心肌纖維化對心臟功能會產生顯著的不良影響。伴隨膠原水平的升高、心肌纖維化的不斷加重，將會引起心肌機械僵硬度增加、心肌間隔增寬，心肌細胞之間出現(xiàn)電生理和舒縮功能障礙。

TNF-α是一種主要由外周巨噬細胞和單核細胞產生的促炎癥作用的細胞因子，參與正常炎癥反應和免疫反應，在一些炎癥性疾病如病毒性心肌炎［5］、自發(fā)性流產［6］、類風濕性關節(jié)炎［7］等中起到了重要作用。同時TNF-α也是導致心臟急性心肌缺血再灌注后影響心肌灌流下降的重要因素，是引起心肌功能受損的重要原因［8］。同時TNF-α可上調L-1β和IL-6表達，加重急性心肌缺血再灌注后心肌纖維化。

由此可見，在急性心肌缺血再灌注時心肌纖維化和TNF-α對心功能起到了重要作用。然而在急性心肌缺血再灌注早期心肌纖維化對心功能的影響目前知之甚少。我們擬建立大鼠急性心肌缺血再灌注模型，觀察不同時間點大鼠心肌纖維化、TNF-α和心功能狀態(tài)的相互關系，探討心肌纖維化對大鼠急性心肌缺血再灌注早期心功能的可能影響。

材料與方法

1 實驗動物及處理 成年雄性SD大鼠（體重230～270g）購買自西安交通大學醫(yī)學院。在整個實驗過程中，遵循美國國立衛(wèi)生研究院于1996年出版的《實驗動物護理和使用指南》和中國國家科學技術委員會在2004年公布的《實驗動物管理規(guī)定》相關要求，給予實驗動物隨意飲食。雄性SD大鼠隨機分為假手術組（Sham組）和急性心肌缺血再灌注組（MI／R組）。急性心肌缺血再灌注組和假手術組分別設定第1天，第3天，第7天不同時間點。在進行單個檢測方法處理時，每組每個時間點檢測6個樣本。

2 大鼠急性心肌缺血再灌注模型的建立 以2%的戊巴比妥鈉（2ml／kg）腹內注射麻醉大鼠，將麻醉的大鼠腹面朝上縛于鼠臺上。行氣管切開，接于小動物呼吸機行正壓輔助通氣（哈佛小動物呼吸機）。沿大鼠胸骨左緣1cm處做縱向切口，逐層分離。于左心耳下方2mm處用6-0無損傷帶線縫合針結扎前降支（假手術組只穿線，不結扎）。結扎前在結扎處放置一直徑為4mm，長5mm的乳膠管，以便剪開結扎的絲線行再灌注。以Ⅱ導聯(lián)心電圖出現(xiàn)ST段抬高和出現(xiàn)左心缺血性顏色改變?yōu)闃藴逝卸毙孕募∪毖?。持續(xù)呼吸機正壓通氣。維持心肌缺血45min，剪開結扎絲線，關閉胸腔。給予青霉素400 000U／kg（1ml）腹腔注射，連續(xù)3d。分別于再灌注第1、3、7天時以烏拉坦過度麻醉，處死取樣。

3 心臟功能的超聲評估 以二維和M型的超聲儀器（VIVID7型，GE公司，美國），分別從長短軸用10s的探頭來觀察心臟功能和結構的改變。用內在分析軟件捕捉每只老鼠連續(xù)3個心動周期的數(shù)字圖像，計算平均值。

4 血流動力學檢測 以2%戊巴比妥鈉溶液麻醉模型鼠后固定于鼠臺。將充滿肝素生理鹽水的導管連于BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)上，經右頸總動脈進入左心室，當動脈壓波形突然出現(xiàn)波浪狀變化，振幅突然變大時，表明已進入左心室內。測量并記錄所需數(shù)據(jù)。記錄完畢后逐漸退出導管，夾閉并結扎頸總動脈近心端后撥出導管。

5 心肌羥脯氨酸測定 按照按照試劑盒的說明書配制試劑，采用堿水解法測定心肌羥脯氨酸含量。羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產生的氧化產物與二甲氨基苯甲醛反應呈現(xiàn)紫紅色，根據(jù)呈色的深淺可換算出心肌羥脯氨酸含量。

6 TNF-α表達水平檢測

6．1 外周血中TNF-α表達檢測：收集大動脈血液樣本約1ml，3000g離心20min。取上清，保存于-80℃以待檢測。采用ELISA試劑盒 （欣博盛公司，中國）檢測大鼠血清TNF-α濃度。

6．2 心肌 TNF-α表達檢測：采用 Western Blot方法檢測心肌TNF-α表達。檢測樣本定位于左室前壁結扎動脈下方。另取AI／R3d組右心和后壁作對照觀察。將心肌組織剪切成細小的碎片。按照每20mg組織加入200μl裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。BCA法測蛋白濃度。上樣量20μg，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，轉NC膜。以5%脫脂奶封閉2h后，加入1∶1000兔抗大鼠 TNF-α抗體（PeproTech，美國），4 ℃孵育過夜，用Tris緩沖鹽溶液（含0．05%吐溫）洗3次。在暗室內，將NC膜浸入增強化學發(fā)光試劑（ECL）顯色，X光片適當曝光后洗片。分析目的蛋白和內參β-actin的 Western-Blotting條帶，結果表示為兩者IOD比值并進行統(tǒng)計學分析。

7 統(tǒng)計學處理 本組使用SPSS16．0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結 果

1 兩組大鼠急性缺血再灌注早期心功能比較見表1。采用心臟超聲和血流動力學檢測心功能變化，發(fā)現(xiàn)在急性缺血再灌注早期反映心臟的收縮功能的有關參數(shù)，如：EF、FS、LVSP、LVEDP等和反映心臟結構的參數(shù)，如：IVSd、LVIDs、EDV、ESV 等與假手術組比較均無顯著變化（P＞0．05）。然而，在相同心率狀態(tài)下，反映舒張功能的參數(shù)，左室內壓最大下降速率（-dp／dtmax），有不同程度的降低。在急性心肌缺血再灌注3d時，-dp／dtmax值與假手術3d該參數(shù)相比較有顯著降低（P＜0．05）。而在急性心肌缺血再灌注第1、3天時，-dp／dtmax值較之假手術組同期雖也有所降低，但無統(tǒng)顯著性差異（P＞0．05）。

2 急性心肌缺血再灌注大鼠早期心肌膠原容積和羥脯氨酸含量對比 見表2。進一步分析急性心肌缺血再灌注心肌纖維化的程度，膠原容積分數(shù)（CVF）即左心室膠原面積于所測視野面積之比。羥脯氨酸（HYP）在膠原蛋白中占13．4%，在彈性蛋白中占極少量，在其它蛋白中均不存在，因此羥脯氨酸的量能反映結締組織疾病總的膠原代謝情況。這兩項指標的檢測可以直接反應心肌纖維化程度。在急性心肌缺血再灌注個時間點，CVF和HYP較假手術組同期明顯增高（P＜0．05），且于再灌注第3天達到最高值。然而，膠原容積分數(shù)僅在結扎動脈（前降支）的供血區(qū)域，左心前壁，表現(xiàn)為異常高值。而在再灌注第3天時，右心和左心后壁的膠原容積分數(shù)與假手術組相仿（P＞0．05）。

表1 兩組大鼠急性缺血再灌注早期心功能比較（±s）

表1 兩組大鼠急性缺血再灌注早期心功能比較（±s）

Sham 組MI／R 組組 別第1天 第3天 第7天 第1天 第3天 第7天375．08±33．56 375．40±22．34 379．20±20．02 IVSd（mm） 1．55±0．28 1．67±0．32 1．59±0．32 1．60±0．18 1．58±0．33 1．57±0．29 IVSs（mm） 2．67±0．13 2．47±0．58 2．55±0．18 2．56±0．37 2．30±0．44 2．55±0．81 LVIDd（mm） 4．51±0．19 3．97±0．16 4．05±0．45 4．51±0．94 3．88±1．48 4．15±0．67 LVIDs（mm） 2．53±0．18 2．57±0．12 2．75±0．27 2．15±0．57 2．30±0．95 2．53±0．79 EF 0．78±0．026 0．75±0．062 0．77±0．086 0．68±0．046 0．66±0．057 0．69±0．094 FS 0．52±0．048 0．50±0．20 0．54±0．078 0．58±0．057 0．56±0．18 0．57±0．096 LVSP（mmHg） 77．42±12．55 76．45±10．25 75．44±14．13 72．52±26．85 70．67±10．15 73．84±10．04 LVEDP（mmHg） 2．19±0．84 2．33±0．59 2．04±0．77 2．09±1．04 2．13±1．09 2．06±0．91 EDV（cm3） 0．27±0．09 0．27±0．12 0．26±0．14 0．25±0．12 0．24±0．14 0．25±0．15 ESV（cm3） 0．039±0．007 0．046±0．019 0．044±0．009 0．033±0．007 0．034±0．009 0．047±0．019＋dp／dtmax（mmHg／ms） 3．80±1．08 3．79±1．06 3．88±1．09 3．72±1．02 3．67±1．16 3．58±2．07-dp／dtmax（mmHg／ms） 2．72±0．38 2．75±0．64 2．69±0．39 2．28±0．86 1．56±0．48＊HR（bpm） 395．80±35．46 385．40±32．34 396．20±18．20 2．37±0．54

3 急性心肌缺血再灌注大鼠早期心肌和血清中TNF-α表達比較 見表2及附圖。通過Western Blot和ELISA方法，我們發(fā)現(xiàn)急性心肌缺血再灌注時心肌和血清中TNF-α的表達均顯著增高（P＜0．05）。在心肌中，TNF-α在急性缺血再灌注各時間點表達均較假手術組大幅增高（P＜0．05），達8～10倍左右，但是其增高也是區(qū)域性的，僅在前降支所支配區(qū)域。然而在再灌注第3天的右心和左心后壁組織中，TNF-α的表達與假手術組持平或略高，并無顯著性差異（P＞0．05）。另外，我們通過ELISA方法檢測血清中TNF-α表達，發(fā)現(xiàn)其表達規(guī)律和心肌中TNF-α為同一性，也是在再灌注第3天時表達最高。

表2 急性心肌缺血再灌注大鼠心肌纖維容積分數(shù)、心肌羥脯氨酸含量以及血清TNF-α濃度（±s）

表2 急性心肌缺血再灌注大鼠心肌纖維容積分數(shù)、心肌羥脯氨酸含量以及血清TNF-α濃度（±s）

Sham 組MI／R 組組 別第1天 第3天 第7天 第1天 第3天 第7天CVF（%） 6．53±2．43 5．52±1．54 5．78±2．14 22．74±2．35＊ 26．74±3．46＊ 21．43±3．72＊HYP （μg／g） 158．53±13．56 150．34±20．53 162．36±22．34 462．56±50．43＊583．56±34．78＊46．78±46．62＊TNF-α（pg／ml） 20．64±1．75 21．34±2．35 24．89±2．43 52．42±4．38＊ 68．24±2．56＊＊ 44．38±5．75＊

附圖 急性心肌缺血再灌注大鼠心肌中TNF-α表達

討 論

本研究顯示：急性心肌缺血再灌注早期大鼠心舒張功能降低與心肌纖維化和TNF-α的表達異常增高密切相關。急性心肌缺血再灌注早期大鼠僅出現(xiàn)舒張功能降低而無明顯得收縮功能減低及心臟結構變化。說明在缺血再灌注時，心功能的降低不僅是心肌細胞的損傷和丟失的結果，也有心肌間質發(fā)生纖維化改變的因素。

心肌纖維化是指心肌細胞外基質中膠原纖維過量積聚、膠原濃度顯著升高或成分發(fā)生改變，它在多種心血管疾病中普遍存在，是心肌對壓力超負荷、炎癥反應、氧化應激等的反應［9，10］。在急性心肌缺血再灌注時，缺血再灌注區(qū)的細胞出現(xiàn)皺縮、崩解、壞死，以及結構紊亂，膠原纖維大量分泌，過度聚集于心肌細胞外和血管周圍［11］。過度聚集的膠原纖維會對心功能產生不良影響，主要是增加心肌僵硬度，導致順應性降低和舒張充盈下降［12］；心肌小動脈周圍膠原纖維增加［13］，引起其儲備能力的下降，從而影響心肌血流供應，進一步加重心肌缺血。但在試驗中我們發(fā)現(xiàn)：在急性心肌缺血再灌注第1、7天時，心臟舒張功能雖有下降，但還未呈現(xiàn)出顯著性差異。這可能是再灌注損傷的過程中，在缺血再灌注部位仍有一部分正常心肌保留下來，發(fā)揮其舒張收縮功能，且纖維化僅局限于模型建立時所結扎血管支配的區(qū)域，而對于非缺血再灌注部位的左心后壁的心肌幾乎沒有影響。

我們發(fā)現(xiàn)急性缺血再灌注心肌細胞的TNF-α與其膠原容積分數(shù)具有密切關系。已往研究證實：在心肌細胞中TNF-α通過活性氧中間體的產生使細胞肥大；通過細胞外基質蛋白誘導心肌纖維化；通過心肌細胞壞死和凋亡的形式導致心肌細胞缺失，然后由纖維組織修復，導致心肌纖維化［14］。同時，血漿TNF-α水平與左心室重構進展及心力衰竭密切聯(lián)系。也有動物實驗證實：給動物注射TNF-α可導致心臟功能障礙及心力衰竭［15］。另一方面，TNF-α可引起心肌成纖維細胞IL-1β和IL-6表達上調，從而加重心肌纖維化程度；并且能夠通過激活并增加基質金屬蛋白酶的表達來改變細胞外基質成分［16］。由此可見，TNF-α對于誘導心肌纖維化的作用是確定且多方面的。

總之，在急性心肌缺血再灌注早期，心臟舒張功能降低是缺血再灌注區(qū)心肌纖維化的結果，而TNF-α的表達增高則是再灌注時心肌纖維化的眾多原因之一。

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