郭娟娟，張龍濤，曾紹校，林美強，張 怡，鄭寶東

(福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州350002)

卡拉膠(Carrageenan，CGN)來源于愛爾蘭苔菜，又叫角叉膠、鹿角膠等，其降解產(chǎn)生的卡拉膠寡糖具有免疫調節(jié)、抗病毒、抗凝血、抗氧化等多種生物活性，在醫(yī)藥、食品等領域具有一定的應用價值，是新功能性食品、新藥品、新化工品的開發(fā)熱點.目前制備卡拉膠寡糖主要依賴于化學法，但化學降解條件不穩(wěn)定，產(chǎn)物雜質不易分離.卡拉膠酶具有專一性，可酶切糖鏈的特定位點[1]，從而制得特定的寡糖，并且反應條件溫和，降解過程易于控制，是卡拉膠寡糖研究的熱點.

微生物是卡拉膠酶開發(fā)的重要來源.目前僅在假單胞菌屬(Pseudomonas carrageenovora)、噬纖維菌屬(Cytophaga)、別單胞菌屬(Alteromonas carrageenovora)、弧菌屬(Vibrio)[2－5]等微生物發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到卡拉膠酶，且尚未見卡拉膠酶規(guī)?；a(chǎn)的報道，篩選新的產(chǎn)卡拉膠酶的微生物是該領域的熱點之一.本研究從角叉菜中分離得到1株κ-卡拉膠降解菌，經(jīng)鑒定，確定為德沃斯氏菌屬(Devosia)，國內外尚未見報道.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料 κ-卡拉膠、λ-卡拉膠、ι-卡拉膠(分析純，購自 SIGMA 公司).

1.1.2 儀器與設備 紫外可見分光光度計(北京譜析通用儀器有限責任公司);DKY-Ⅱ恒溫調速回轉式搖床(上海社科自動化設備有限公司);RXZ-280B型培養(yǎng)箱(新江南儀器有限公司);HC014-11-01滅菌鍋(上海東亞壓力容器制造有限公司);H-1850R離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);S1000 Thermal Cycler PCR儀;BIO RAD核酸電泳儀.

1.1.3 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基:κ-卡拉膠2 g;無機鹽母液100 mL;海水900 mL;pH 7.5.

初篩培養(yǎng)基:氯化鈉15 g;κ-卡拉膠15 g;無機鹽母液100 mL;水900 mL;pH 7.5.

復篩培養(yǎng)基:氯化鈉15 g;κ-卡拉膠2 g;酵母膏1 g;無機鹽母液100 mL;水900 mL;pH 7.5.

傳代培養(yǎng)基(改良2216 E培養(yǎng)基):蛋白胨5 g;酵母膏1 g;κ-卡拉膠15 g;海水800 mL;蒸餾水200 mL;pH 7.5.

產(chǎn)酶培養(yǎng)基:氯化鈉15 g;κ-卡拉膠2 g;酵母膏1 g;無機鹽母液100 mL;水900 mL;pH 7.5.無機鹽母液:NaNO320 g;MgSO47H2O 5 g;K2HPO410 g;CaCl21 g;蒸餾水1 L.

1.2 樣品采集與處理

角叉菜樣品取自福建省綠麒食品膠體有限公司，搗碎后用人工海水(30%海鹽配置)浸泡，常溫靜置3 d，用移液管輕輕吸取上清液，備用.

1.3 菌株篩選

1.3.1 富集培養(yǎng) 分別取1 mL樣品上清液加入到盛有25 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中28℃，165 r·min－1搖瓶培養(yǎng)3 d后，用無菌移液管從中吸取5 mL培養(yǎng)液移至另一盛有25 mL新鮮富集培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng).反復操作4次后，對明顯混濁的培養(yǎng)液進行初篩分離.

1.3.2 初篩 取0.1 mL富集培養(yǎng)液涂布初篩分離培養(yǎng)基平板.28℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)，挑取周圍形成明顯透明圈和凹坑的菌落劃線初篩培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落移接傳代培養(yǎng)基斜面，獲得卡拉膠降解菌純培養(yǎng).

1.3.3 復篩 取卡拉膠降解菌純培養(yǎng)物接種到復篩培養(yǎng)基三角瓶中(250 mL三角瓶裝液30 mL)，32℃、150 r·min－1振蕩培養(yǎng)24 h后，取1 mL液體種子接種產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶裝液30 mL)，32℃、150 r·min－1振蕩培養(yǎng) 48 h.發(fā)酵液離心(4000 r·min－1，4 ℃，9 min)去除沉淀細胞，取上清液測定卡拉膠降解酶活力.

1.4 酶活力測定

取1 mL粗酶液加入到盛有20 mL 0.5%卡拉膠底物的三角瓶中，于32℃振蕩反應1 h，對照組用1 mL滅活酶液和20 mL底物溶液混合.以反應液中還原糖的增加量作為檢測酶活力的指標.還原糖的測定則采用 DNS(3，5-二硝基水楊酸)法[4，6].取1 mL 反應液加1 mL DNS溶液，沸水浴反應5 min后冷卻，定容至25 mL，以滅活反應液為對照，于520 nm下測定吸光值.以半乳糖做標準曲線，根據(jù)反應組和對照組吸光值的差值計算還原糖的產(chǎn)生量[3，7].1個酶活力單位(U)定義為在32℃條件下，1 min產(chǎn)生1 μg還原糖(以半乳糖計)所需要的酶量.

酶活力公式:酶活力(U·mL－1)=(D+0.011)×180.5 ×2 ×n/0.1420 ×t

D:吸光度;n:稀釋倍數(shù)21倍;t:反應時間60 min;標準曲線的斜率為0.1420.

1.5 生長與產(chǎn)酶曲線測定

在發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，取種子液于10個裝有30 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的錐形瓶中，每隔8 h測定生物量及酶活.

1.6 菌種鑒定

1.6.1 生理生化鑒定 將目的菌株在普通電子顯微鏡下觀察其形態(tài)并記錄，按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第八版)進行生理生化指標鑒定.

1.6.2 16S rDNA測序鑒定 收集菌體，參照DNA抽提試劑盒提取細菌基因組(由上海生工提供)，提取出的細菌基因組為模板進行采用16S細菌通用PCR引物進行PCR擴增得到其16S rDNA[8].將16S rDNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上進行同源性比對，確定該菌株的分類地位.

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)卡拉膠酶菌株的初篩與復篩

經(jīng)初篩，一共得到60株能夠降解κ-卡拉膠的菌株，將這60株菌進行復篩，一共有13株菌周圍出現(xiàn)了較為明顯的凹陷水解圈，凹陷內有無色透明液體，水解圈呈規(guī)則的圓形，邊緣整齊光滑(圖1).其中2號菌株的降解圈明顯比其他菌株的降解圈大且透明，經(jīng)革蘭氏染色為陰性，因此選取2號菌進行深入研究.為了了解2號菌對其他類型卡拉膠的降解性，將2號菌株在分別以λ-卡拉膠、ι-卡拉膠為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)并無明顯生長.將該酶加入分別只含λ-卡拉膠、ι-卡拉膠的底物溶液中進行降解并未顯示活性.因此初步判斷為 κ-卡拉膠降解菌[8－10].

2.2 拉膠酶的酶活測定

將經(jīng)過復篩的13株水解圈較明顯的細菌，采用DNS法測定其降解κ-卡拉膠的酶活力，其結果如表1所示，2號菌和9號菌具有較高的酶活性，測定的酶活分別為63.30、49.07 U·mL－1.

圖1 菌株Fjfst-330降解κ-卡拉膠的凹陷Fig.1 Strain Fjfst-330 with κ-carrageenase activation

表1 菌株的酶活Table 1 Enzyme activity of the strain

2.3 卡拉膠酶的生長和產(chǎn)酶曲線

取活性最高的2號菌株進行生長曲線與產(chǎn)酶曲線的測定(圖2).2號菌株的生物量在8 h達到最高，8－48 h為平穩(wěn)期，48 h后進入衰亡期.當發(fā)酵培養(yǎng)到56 h時，酶活達到最大值，隨后酶活力迅速下降.在微生物產(chǎn)酶動力學中，這種產(chǎn)酶形式屬于滯后合成型[11]，即在細胞進入平穩(wěn)期后，酶才開始合成并大量累積，許多水解酶都屬于這一類[5，7，12].

圖2 生長與產(chǎn)酶曲線Fig.2 The curve of growth and κ-carrageenase-producing

2.4 菌種鑒定

2.4.1 生理生化鑒定 2號菌在平板培養(yǎng)基上菌落呈淺黃色，通過電子顯微鏡觀察，其形態(tài)為細小的短桿菌，單生鞭毛.對2號菌株進行生理生化鑒定(表2).參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[13]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]，并結合菌株的細胞形態(tài)學觀察，初步將2號菌株歸入德沃斯氏菌屬.

2.4.2 16S rDNA的克隆及序列測定 進一步確定2號菌的分類學地位，對2號菌株16S rDNA測序分析，其基因序列長度為1473 bp.將測序結果提交至核糖體數(shù)據(jù)庫 http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp，進行Blast比對表明，該序列與 Devosia chinhatensis具有 93.4% 的同源性[15]，其 NCBI上登錄號為EF433462.初步將該細菌歸屬于德沃斯氏菌屬，并將其命名為Devosia sp.Fjfst-330.

表2 菌株的生理生化特性1)Table 2 Physiological and biochemical characteristics of the strain

3 討論

本研究從角叉菜表面分離到多株能夠水解卡拉膠的菌株，經(jīng)過比較各菌株所產(chǎn)生水解圈的大小判斷其降解卡拉膠的能力，對其中1株水解圈最大的菌Fjfst-330進行重點研究.由于卡拉膠的分類較多，目前工業(yè)生產(chǎn)使用的主要有κ-型、λ-型和ι-型，因此進一步在3種卡拉膠上進行純化，發(fā)現(xiàn)菌株Fjfst-330只在κ-卡拉膠上有生長并有較大水解圈.經(jīng)16S rDNA測序比對，生理生化指標測定，與德沃斯氏菌屬有較高的同源性，因此初步命名為Devosia sp.Fjfst-330.該菌屬為產(chǎn)κ-卡拉膠酶的新屬，目前國內外尚未見相關報道.

菌株Fjfst-330培養(yǎng)過程中，其生長及產(chǎn)酶曲線并非同步合成.菌株在8 h時生物量最大，而在56 h時，酶合成及積累量最大，從產(chǎn)酶動力學分析屬于滯后合成型，這與牟海津[4]的研究結果不同.從產(chǎn)酶曲線推測，菌株Fjfst-330在利用κ-卡拉膠為碳源降解時，可能受到分解代謝物的阻遏且同時生成不同酶.該菌為產(chǎn)κ-卡拉膠酶的新菌屬，其酶種類與酶活性在國內外也未見報道.

菌株Fjfst-330在初步篩選過程中，表現(xiàn)出較高的產(chǎn)酶能力，測定其酶活達63.3 U·mL－1.與國內外已有卡拉膠酶活力相比，噬瓊膠菌屬(Tamlana agarivorans)為50·75 U·mL－1[16]、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)為 6.788 U·mL－1[17]、黃桿菌屬(Flavobacterium)為 149.8 U·mL－1[3]、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)為26.5 U·mL－1[2]，菌株 Fjfst-330的產(chǎn)酶活力具有較好的優(yōu)勢.通過發(fā)酵優(yōu)化，其產(chǎn)酶能力與產(chǎn)酶量將得到進一步提高.目前，我國尚未有工業(yè)化的卡拉膠菌株，所需的卡拉膠酶購自外國公司，價格昂貴.本菌株具有一定的生產(chǎn)潛力，為開發(fā)卡拉膠酶及其工程菌提供良好的基礎材料.

[1]MAUD L，PI N C，WILLIAM H.Physical state of kappa-carrageenan modulates the mode of action of kappa-carrageenase from Pseudoalteromonas carrageenovora[J].Biochemical Journal，2009，419:545 －553.

[2]彭小珍，吉宏武，劉喚明，等.施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri產(chǎn)卡拉膠酶液體發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2007，10:7 －11.

[3]唐志紅，呂家森，張振，等.產(chǎn)卡拉膠酶海洋菌株的篩選和酶學性質的初步研究[J].食品科技，2011，36(6):18－21.

[4]牟海津.酶法制備κ-新卡拉四、六糖的化學及生物學研究[D].中國海洋大學，2003.

[5]SUN F X，MA Y X，WANG Y，et al.Purification and characterization of novel κ-carrageenase from marine TamLana sp.HC4[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2010，28(6):1139 －1145.

[6]SMITH J，MOUNTFORT D，F(xiàn)ALSHAW R.A zymogram method for detecting carrageenase activity[J].Analytical Biochemistry，2006，347(2):336 －338.

[7]LI S Y，JIA P P，WANG L N，et al.Purification and characterization of a new thermostable κ-Carrageenase from the marine bacterium Pseudoalteromonas sp.QY203[J].Journal of Ocean University of China，2013，12(01):155 －159.

[8]LIU Z M，LI G Y，MO Z L，et al.Molecular cloning，characterization，and heterologous expression of a new κ-carrageenase gene from marine bacterium Zobellia sp.ZM-2[J].Appl Microbiol Biotechnol，2013，97:10057 －10067.

[9]ZHOU M H，MA J S，LI J.A κ-Carrageenase from a newly isolated Pseudoalteromonas-like bacterium，WZUC10[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2008，13:545 －551.

[10]Ma Y X，DONG S L，LIU S L，et al.Optimization of κ-carrageenase production by Pseudoalteromonas sp.AJ5[J].Acta Microbiologica Sinica，2008，48(6):757 －764.

[11]郭勇.微生物水解酶類生物合成的模式[J].中國釀造，1985，5:1－5.

[12]JOUANNEAU D，BOULENGUER P，MAZOYER J.Enzymatic degradation of hybrid i-/m-carrageenan by Alteromonas fortis i-carrageenase[J].Carbohydrate Research，2010，345(7):934 －940.

[13]布坎南 R E，吉本斯 N E.伯杰氏細菌鑒定手冊(第8版)[M].北京:科學出版社，1984:338－340.

[14]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學出版社，2001.

[15]劉斌，陳路劼，吳美愛，等.福州永泰溫泉嗜熱菌的分離與鑒定[J].福建農(nóng)林大學學報:自然科學版，2008，37(6):657－661.

[16]李俊，馬悅欣，馮兵，等.產(chǎn)κ-卡拉膠酶菌株的篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].大連水產(chǎn)學院學報，2009，24(1):24－29.

[17]馬悅欣.Pseudoalteromonas sp.AJ5-913的κ-卡拉膠酶酶學性質及酶解產(chǎn)物分析[D].中國海洋大學，2008.