肖雅敏，周 峽，張紹升

(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002)

香蕉(Musa paradisiaca)是福建省重要的經(jīng)濟(jì)作物之一.據(jù)調(diào)查，福建省香蕉根系及根際土壤中存在大量寄生線蟲.其中，重要的香蕉線蟲病害包括:香蕉根結(jié)線蟲病，病原線蟲為南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)、花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)和巨大根結(jié)線蟲(M.megadora)［1］;香蕉腎形線蟲病，病原為腎狀腎形線蟲(Rotylenchulus reniformis)［2］.香蕉上還分離鑒定了短體線蟲(Pratylenchus spp.)、矮化線蟲(Tylenchorhynchus spp.)、螺旋線蟲(Helicotylenchus spp.)、莖線蟲屬(Ditylenchus spp.)、輪線蟲(Criconemoides spp.)、絲尾墊刃線蟲(Filenchus spp.)、墊刃屬(Tylenchus spp.)等［3－5］.有關(guān)這些線蟲的分類地位及其對(duì)香蕉的危害性尚未見報(bào)道.近2年筆者從福建香蕉主產(chǎn)區(qū)的香蕉根部采集了一批螺旋線蟲和紐帶線蟲(Hoplolaimus)的樣本，通過形態(tài)學(xué)鑒定和線蟲的rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3測序，確定其分類地位，以期為進(jìn)一步病害診斷與防治研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 線蟲樣本的采集和分離

從福建省漳州、福州、莆田、南平、寧德等香蕉產(chǎn)區(qū)，采用交叉五點(diǎn)采樣法，共采集62份香蕉根樣本.采用改良貝曼漏斗法［6］分離根組織上的線蟲.

1.2 線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

挑取一定數(shù)量線蟲樣本制作臨時(shí)玻片，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察和顯微計(jì)測.顯微計(jì)測參照de-Man公式［7］，計(jì)測項(xiàng)目及符號(hào)如下:L=蟲體全長;a=體長/最大體寬;b=體長/頭端至食道與腸接合處距離;b'=體長/頭端至食道末端距離;c=體長/尾長;c'=體長/尾部最大體寬;O=口針基部球至背食道腺開口距離×100/口針全長;M=針錐長度×100/口針長度;V=陰門距頭端距離×100/體長;EP=排泄孔至體前端的長度;BW=最大體寬;ABW=肛門處體寬;SPi=交合刺長度;gu=引帶長度.

線蟲體表細(xì)微結(jié)構(gòu)采用掃描電子顯微鏡觀察拍照，掃描電鏡樣本的制備參照文獻(xiàn)［8］.植物線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定和分類參照文獻(xiàn)［9－11］.

1.3 線蟲的分子鑒定

參照文獻(xiàn)［12－14］，對(duì)線蟲的rDNA-ITS區(qū) (ITS1、5.8S、ITS2和部分18S和28S)和28S rDNA-D2/D3區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增.用單條線蟲提取DNA，將清洗完的單頭線蟲挑至滴有15 μL ddH2O的載玻片上，切成2－3段，將線蟲片段懸浮液吸入預(yù)冷的 Eppendolf管中，再加入1.5 μL蛋白酶 K(1 mg·mL－1)和1.5 μL 10×PCR buffer，混勻后簡單離心，－20℃放置3 h以上.取出后放入PCR儀中，65℃消化1 h，95℃保溫15 min，降溫至4℃，加入PCR反應(yīng)體系作模板或－20℃保存?zhèn)溆?

rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3區(qū)擴(kuò)增選用通用引物.ITS區(qū)的上游引物5'-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3'或5'-TCCTCCGCTAAATGATATG-3';下游引物5'-TTGATTACG TCCCTGCCTTT-3'.D2/D3區(qū)的上游引物5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3';下游引物5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3'.

將測序結(jié)果整理拼接后，登錄GenBank獲得相應(yīng)登錄號(hào).通過DNAMAN 5.0軟件分別對(duì)ITS區(qū)和D2/D3區(qū)序列進(jìn)行一致性分析.

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從GeneBank公共數(shù)據(jù)庫上下載有關(guān)線蟲的相應(yīng)序列，通過Clustalx 1.83軟件分別對(duì)ITS序列和D2/D3序列做比對(duì)分析，應(yīng)用MEGA 5.1對(duì)序列進(jìn)行整理;然后利用PAUP 4.0軟件，以鄰位連接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中自展檢驗(yàn)(bootstrap value)重復(fù)抽樣次數(shù)為10000次;最后通過MEGA 5.1軟件，根據(jù)Tijiama-Nei模型計(jì)算多序列間的遺傳距離.

2 結(jié)果與分析

在供檢測的62份香蕉根樣本中，47份檢測出雙宮螺旋線蟲［Helicotylenchus dihystera(Cobb，1893)S-her，1961］，12份檢測出多帶螺旋線蟲［Helicotylenchus multicinctus(Cobb，1893)Golden，1956］，8 份檢測出塞氏紐帶線蟲(Hoplolaimus seinhorsti Luc，1958).

2.1 雙宮螺旋線蟲

分類地位:墊刃目(Tylenchida)墊刃總科(Tylenchoidea)紐帶科(Hoplolaimidae)螺旋線蟲屬(Helicotylenchus).

形態(tài)測量值:莆田種群:♀:n=23;L=653.3(595.9－714.4)μm;a=24.3(21.7－26.7);b=5.5(5.0－6.3);b'=4.4(3.9－4.9);c=38.3(34.7－43.0);c'=1.1(0.1－1.2);口針長 =26.9(25.7－28.1)μm;O=46.1(40.8－52.7);M=49.0(47.0－51.8);DGO=12.3(11.1－14.7)μm;V=63.1(57.3－67.1);EP=109.2(100.8－117.9)μm;尾長 =17.1(14.6－18.8)μm;BW=26.9(25.3－28.7)μm;ABW=16.3(15.0－17.3)μm.

♂:n=1;L=642.9 μm;a=26.5;b=8.3;b'=6.4;c=33.1;c'=1.7;口針長 =25.3 μm;DGO=13.4 μm;O=53.0;尾長 =19.4 μm;ABW=11.7 μm;SPi=25.5 μm.

漳州種群:♀:n=23;L=626.2(562.6－761.8)μm;a=25.4(22.9－31.1);b=5.9(5.2－7.1);b'=4.2(3.7－5.1);c=36.5(34.2－44.8);c'=1.2(1.0－1.4);口針長 =25.1(23.6－26.5)μm;O=54.2(48.0－60.2);M=48.1(45.8－52.3);DGO=13.6(11.8－14.5)μm;V=63.1(57.3－67.1);EP=101.8(90.3－111.1)μm;尾長 =17.2(15.1－18.6)μm;BW=24.7(22.4－26.1)μm;ABW=14.5(12.5－15.9)μm.

形態(tài)特征(圖1A－I):雌蟲:蟲體經(jīng)溫?zé)釟⑺篮蟪事菪?唇區(qū)近半球狀，前端稍平，頭環(huán)4－5個(gè);口針發(fā)達(dá)，針錐約為口針長度的1/2，口針基部球前緣稍平或略微凸起呈齒狀.背食道腺開口位于口針基部球后約為口針長的1/2處，半月體位于排泄孔前1－3個(gè)體環(huán)處.雙卵巢，對(duì)伸;受精囊近圓形，內(nèi)無精子.側(cè)區(qū)網(wǎng)格化，4條側(cè)線，體后部的2條內(nèi)側(cè)線結(jié)合成“V”或“Y”形.尾向腹面彎曲，末端鈍或有尾尖突.側(cè)尾腺口位于肛門前5－10個(gè)體環(huán)處，尾腹環(huán)6－9個(gè).

雄蟲:蟲體前端與雌蟲基本相似.尾端有指狀凸起;交合傘包至尾尖.

分布地:漳州、福州、莆田、南平、寧德.

圖1 雙宮螺旋線蟲、多帶螺旋線蟲、塞氏紐帶線蟲的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Helicotylenchus dihystera，Helicotylenchus multicinctus and Hoplolaimus seinhorsti

2.2 多帶螺旋線蟲

分類地位:墊刃目墊刃總科紐帶科螺旋線蟲屬.

形態(tài)測量值:漳州種群:♀:n=20;L=546.1(460.9－635.6)μm;a=25.5(19.2－31.5);b=5.6(5.2－6.2);b'=4.4(3.8－4.9);c=40.8(34.4－55.6);c'=1.2(1.0－1.3);尾長 =13.3(10.3－16.1)μm;口針長 =24.4(23.4－25.2)μm;DGO=8.8(7.7－9.6)μm;V=68.0(63.9－74.2);O=35.9(31.2－40.4);M=46.3(44.7－49.0);EP=83.4(76.1－94.3)μm;BW=21.2(17.9－30.9)μm;ABW=11.3(10.0－15.1)μm.

♂:n=4;L=501.6(495.1－508.2)μm;a=26.0(23.7－28.3)μm;b=5.2(5.0－6.4);b'=4.3(4.3－4.4);c=37.0(36.8－37.1);c'=1.1(1.1－1.2);口針長 =22.3(22.2－22.4)μm;DGO=8.3(8.2－8.5)μm;O=37.4(36.7－38.1);尾長 =13.6(13.4－13.7)μm;ABW=11.8(11.8－11.9)μm;SPi=22.5(20.1－25.0)μm.

形態(tài)特征(圖1J－S):雌蟲:蟲體經(jīng)溫?zé)釟⑺篮蟪省癈”形.唇區(qū)半球形，稍縊縮，有4－5個(gè)唇環(huán)(通常4個(gè));口針較粗壯，基部球圓形或扁圓形，針錐約為口針長度的46%.食道腺于腹面緊密覆蓋在腸前部.排泄孔在食道—腸瓣膜的稍前方.半月體位于排泄孔前1－3個(gè)體環(huán)處.雙卵巢，對(duì)伸，陰門橫裂內(nèi)陷，受精囊近圓形，充滿精子.側(cè)帶有4條側(cè)線.尾較短，尾端近半圓形.側(cè)尾腺口位于肛門前1－6個(gè)體環(huán)處.

雄蟲:蟲體前端與雌蟲相似.交合刺和引帶明顯，交合傘包至尾端.分布地:漳州、福州.

2.3 塞氏紐帶線蟲

分類地位:墊刃目墊刃總科紐帶科螺旋線蟲屬.

形態(tài)測量值:福州種群:♀:n=14;L=1329.0(1246.3－1494.9)μm;a=28.3(26.1－31.9);b=9.1(8.3－10.1);b'=7.2(6.7－8.0);c=49.4(43.0－55.8);c'=0.8(0.8－0.9);尾長 =27.0(23.9－30.2)μm;口針長 =42.2(38.2－45.5)μm;DGO=5.1(4.6－5.8)μm;V=55.7(53.2－56.9);O=12.0(10.5－14.7);M=48.5(44.9－50.6);EP=129.1(115.4－145.1)μm;BW=47.3(44.3－52.0)μm;ABW=28.9(23.9－30.2)μm.

形態(tài)特征(圖1T－X):雌蟲:蟲體經(jīng)溫?zé)釟⑺篮笙蚋姑鎻澢省癈”形.唇區(qū)高，顯著縊縮，骨質(zhì)化明顯，具4個(gè)唇環(huán)，唇盤底部有數(shù)條縱紋將唇環(huán)分割成網(wǎng)格狀;側(cè)帶退化，結(jié)構(gòu)簡單，僅形成1條溝紋.口針強(qiáng)壯，口針基部球發(fā)達(dá)，呈郁金香形，針錐長占口針長度的一半左右;中食道球圓，其直徑約為19.9 μm;排泄孔位于食道峽部腹面.食道腺覆蓋腸的背面和側(cè)面.陰門位于蟲體近中部，有陰門蓋，陰唇厚，稍凸起.雙生殖管，對(duì)伸.側(cè)尾腺口大、盤狀，2個(gè)側(cè)尾腺口分別位于蟲體兩側(cè)陰門的前后側(cè)帶內(nèi).尾部短，具腹環(huán)10－15個(gè)，末端呈半圓形，環(huán)紋包至尾端.未發(fā)現(xiàn)雄蟲.

分布地:漳州、福州.

2.4 分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 序列測定結(jié)果 對(duì)雙宮螺旋線蟲莆田種群PT63、雙宮螺旋線蟲漳州種群ZZA98、多帶螺旋線蟲漳州種群ZZE98、塞氏紐帶線蟲福州種群FZ92測序結(jié)果表明，ITS區(qū)擴(kuò)增片段長度分別為1317、1269、1261、1266 bp;D2/D3擴(kuò)增片段長度分別為787、787、788、792 bp.將上述測序結(jié)果提交GeneBank，獲得序列登錄號(hào).這4個(gè)種群ITS區(qū)序列的登錄號(hào)分別為 KF443215、KF486505、KF443216、KF486504;D2/D3區(qū)序列的登錄號(hào)分別為 KF443217、KF486503、KF443214、KF443213.

2.4.2 序列分析 將4個(gè)種群PT63、ZZA98、ZZE98、FZ92的 rDNA-ITS區(qū)序列與GenBank(http:∥www.ncb.iclm.nih.gov)中已登錄序列進(jìn)行比對(duì)分析以及通過DNAMAN軟件的一致性分析顯示，KF443215與基因庫序列DQ309585(Helicotylenchus dihystera，1317 bp)的相似性99%，一致性99.1%;而KF486505與FJ440620(Helicotylenchus dihystera，1261 bp，馬來西亞)的序列相似性97%，一致性97.2%;將2個(gè)雙宮螺旋線蟲不同地理種群的自測序列KF443215(ITS1區(qū)656 bp、ITS2區(qū)204 bp)與KF486505(ITS1區(qū)650 bp、ITS2區(qū)208 bp)進(jìn)行比對(duì)分析得到一致性97.4%.這說明KF443215與DQ309585的同源性最高，而KF486505和自測序列KF443215的同源性最高.KF443216與 FJ460173(Helicotylenchus multicinctus，1206 bp)的序列相似性99%，一致性99.5%，二者的親緣性最近.KF486504與EU515327(Hoplolaimus seinhorsti，619 bp)的序列相似性99%，一致性99.9%，序列僅在18S rRNA上發(fā)生一個(gè)堿基置換，ITS1區(qū)序列完全一致.

對(duì)4個(gè)種群 PT63、ZZA98、ZZE98、FZ92的28S rDNA-D2/D3區(qū)序列的比對(duì)分析顯示，KF443217、KF486503與HM014260(Helicotylenchus dihystera，575 bp)的相似性均達(dá)到99%，一致性分別為98.9%、98.7%;而2個(gè)自測序列間的一致性達(dá)到99.8%，說明這2個(gè)地理種群間的親緣關(guān)系最近.KF443214與HM014292(Helicotylenchus multicinctus，576 bp)相似性 99%，一致性 99.4%，二者的親緣關(guān)系最近.KF443213與DQ328752(Hoplolaimus seinhorsti，562 bp)相似性與一致性都達(dá)到100%.

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

在序列分析中發(fā)現(xiàn)，塞氏紐帶線蟲KF486504的rDNA-ITS區(qū)序列與DQ309584(Hoplolaimus columbus，1269 bp，臺(tái)灣)的序列相似性98%;塞氏紐帶線蟲KF443213的28S rDNA-D2/D3區(qū)序列與EU554665(Hoplolaimus columbus，996 bp，美國)的相似性與一致性均達(dá)到100%，與EU626791(Hoplolaimus seinhorsti，996 bp，美國)的相似性99%，一致性99.9%.據(jù)此，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步探明這幾個(gè)種群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.從紐帶線蟲的ITS區(qū)和D2/D3區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2A－B)可以看出，二者具有類似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu).結(jié)合這2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹信息，紐帶線蟲大致形成2個(gè)大的進(jìn)化分支.H.columbus和塞氏紐帶線蟲屬于第Ⅱ分支.D2/D3序列系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2B)的分支Ⅱ中KF443213與H.columbus和H.seinhorsti種群間的遺傳距離僅為0.1%，界限不清晰.ITS1序列系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2A)的分支Ⅱ中H.columbus和H.seinhorsti種間的遺傳距離1.4%－2.1%，KF486504與EU515327的遺傳距離0.1%.這說明ITS區(qū)比D2/D3區(qū)更能揭示H.columbus和H.seinhorsti種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.

圖2 紐帶屬線蟲rDNA-ITS1和28S rDNA-D2/D3序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining tree for Hoplolaimus species based on rDNA-ITS1 regions and 28S rDNA-D2/D3 regions from 4 Hoplolaimus species populations

3 討論

通過形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)測定，確定了寄生于福建省香蕉根的雙宮螺旋線蟲、多帶螺旋線蟲和塞氏紐帶線蟲.多帶螺旋線蟲和塞氏紐帶線蟲在福建省香蕉上為首次報(bào)道.調(diào)查發(fā)現(xiàn)，螺旋線蟲在福建省香蕉產(chǎn)區(qū)普遍分布.據(jù)報(bào)道，多帶螺旋線蟲是香蕉上最常見的優(yōu)勢病原線蟲之一，其為害癥狀與穿孔線蟲相似，會(huì)引起香蕉植株矮化、爛根和蕉株倒塌［7］.因此，螺旋線蟲對(duì)香蕉的危害值得注意.塞氏紐帶線蟲在福建省僅在橄欖上有報(bào)道［15］，對(duì)香蕉的危害性尚不明確.

本研究構(gòu)建了紐帶線蟲的ITS區(qū)和D2/D3區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化樹，2個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹均表明紐帶線蟲的不同種群可分為2條分支.而ITS區(qū)比D2/D3區(qū)更能揭示紐帶線蟲的種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，特別是對(duì)塞氏紐帶線蟲和H.columbus這些近似種的同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析更加有效.

［1］張紹升，翁自明.福建省根結(jié)線蟲種類鑒定［J］.福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1991，20(2):158－164.

［2］周峽，張錦恒，張紹升.香蕉假植苗腎形線蟲病的發(fā)生與病原鑒定［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，41(5):460－463.

［3］張紹升.福建省香蕉寄生線蟲種類調(diào)查［J］.福建果樹，1991(2):32－34.

［4］張紹升.香蕉上兩種矮化線蟲的鑒定［M］∥王琦.植物病理學(xué)研究進(jìn)展.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，1995:338－342.

［5］周峽，李世通，張紹升，等.福建省漳州地區(qū)香蕉寄生線蟲的初步調(diào)查與鑒定［M］∥廖金鈴.中國線蟲學(xué)研究(第四卷).北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2012:29－33.

［6］BROOKS F E.Plant-parasitic nematodes of banana in American Somoa［J］.Nematropica，2004，34(1):65－72.

［7］張紹升.植物線蟲病害診斷與治理［M］.福州:福建科學(xué)技術(shù)出版社，1999:73－74，85－87.

［8］郭素枝，章淑玲，陳玉芬，等.甘薯莖線蟲的掃描電鏡制樣方法［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005，34(1):44－45.

［9］SIDDIQI M R.Helicotylenchus dihystera［M］∥Commonwealth Institute of Helminthology.Descriptions of plant-parasitic nematodes(1).London:Commonwealth Agricultural Bureaux，1972:9.

［10］SIDDIQI M R.Helicotylenchus multicinctus［M］∥Commonwealth Institute of Helminthology.Descriptions of plant-parasitic nematodes(2).London:Commonwealth Agricultural Bureaux，1973:23.

［11］BERGE V D.Hoplolaimus seinhorsti［M］∥Commonwealth Institute of Helminthology.Descriptions of plant-parasitic nematodes(6).London:Commonwealth Agricultural Bureaux，1976:76.

［12］趙雷，鄭煒，梅圓圓，等.基于rDNA的PCR-RFLP及序列分析對(duì)四種螺旋線蟲的分子鑒定［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，18(5):981－984.

［13］BAE C H，SZALANSKI A L，ROBBINS R T.Molecular analysis of the lance nematode，Hoplolaimus spp.，using the first internal transcribed spacer and the D1-D3 expansion segments of 28S ribosomal DNA［J］.Nematology，2008，40(3):201－209.

［14］SUBBOTIN S A，RENATO N I，MARIETTE M，et al.Diversity and phylogenetic relationships within the spiral nematodes of Helicotylenchus Steiner，1945(Tylenchida:Hoplolaimidae)as inferred from analysis of the D2-D3 expansion segments of 28S rRNA gene sequences［J］.Nematology，2011，13(3):333－345.

［15］張紹升，肖榮鳳，林乃銓，等.福建橄欖寄生線蟲種類鑒定［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2002，31(4):445－451.