程彪平， 李來生 ， 周仁丹， 聶桂珍， 張宏福

（南昌大學(xué)分析測試中心，江西 南昌330047）

由于蛋白質(zhì)、生物酶、核糖核酸等本身都具有手性，當(dāng)手性藥物進入生物體后，與生物大分子之間產(chǎn)生嚴(yán)格的立體結(jié)構(gòu)匹配，從而導(dǎo)致藥物對映體顯示出不同的藥理和毒理作用。β-受體阻滯劑是一類臨床廣泛使用的手性藥物，常用于治療高血壓、心絞痛及心律失常等疾病［1］。如阿替洛爾的S-對映體具有降血壓和心動過緩的藥效，而R-對映體則無此效果［2］。Giachetti 等［3］和Biswas 等［4］還分別發(fā)現(xiàn)阿替洛爾對映體在體內(nèi)的藥代動力學(xué)和毒性也存在較大的差異。因此發(fā)展這類藥物的對映體快速拆分新方法，對深入研究藥物的作用機理、毒性、代謝，乃至藥物生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制都有十分重要的意義。

阿替洛爾（氨酰心安，atenolol）屬于含氨基丙醇類結(jié)構(gòu)的手性藥物，結(jié)構(gòu)見圖1。其對映體拆分方法主要有誘導(dǎo)結(jié)晶拆分法、化學(xué)拆分法、膜拆分法、酶拆分法、色譜拆分法和毛細管電泳拆分法等［5-8］。初永寶等［8］以甲酰胺為介質(zhì)，檸檬酸-三羥甲基氨基甲烷為電解質(zhì)，采用非水毛細管電泳法成功地拆分了阿替洛爾等9 種手性藥物，其中阿替洛爾對映體的拆分時間為50 min。手性高效液相色譜法對測定藥物的立體化學(xué)差異性具有更好的適用性，除此之外，它也是制備光學(xué)純手性藥物的有效工具。Bhushan 等［9］以三聚氰氯為手性衍生劑，在C18 液相色譜柱上間接地拆分了阿替洛爾等4 種β-受體阻滯劑藥物。周采菊等［10］采用磺丁基醚β-環(huán)糊精流動相添加劑法，在Kromasil C18 柱上拆分了阿替洛爾對映體。目前采用固定相直接拆分的應(yīng)用較普遍。Agustian 等［11］采用Chiralcel OD-H 纖維素手性柱，以正己烷-異丙醇-二乙胺為流動相，在正相色譜條件下拆分了阿替洛爾對映體，并考察了不同溶劑溶解阿替洛爾對分離的影響。張娟紅等［12］也采用Chiralcel OD-H 柱，以含0.2% （v／v）氨水正己烷溶液和乙醇／異丙醇／氨水（90∶10∶0.2，v／v／v）混合溶液分別為流動相A 和B，發(fā)展了一種LC-MS-MS 拆分和檢測普萘洛爾、美托洛爾、阿替洛爾和比索洛爾對映體的方法。Mikuldas 等［13］采用Chiralpak AD直鏈淀粉手性柱，以正己烷-乙醇為流動相，研究了單一阿替洛爾對映體的液相色譜制備方法。EI Deeb［14］采用Chirobiotic V2 萬古霉素柱，以乙腈-甲醇-醋酸-三乙胺為流動相，拆分了阿替洛爾對映體，分析時間約40 min。Wang 等［15］制備了全苯氨基甲酸酯化β-環(huán)糊精柱，拆分了普萘洛爾等4 種β-阻滯劑對映體，但不包括阿替洛爾。

最近，我們實驗室制備了一種二硝基苯醚化β-環(huán)糊精鍵合有序介孔SBA-15 手性固定相（NESP），報道了其制備方法和基本手性分離性能的評價［16］，其結(jié)構(gòu)見圖1。本文采用這種新型固定相，優(yōu)化了色譜分離條件，實現(xiàn)了阿替洛爾對映體的快速拆分（約20 min），并建立了一種測定阿替洛爾片劑中對映體含量的新方法。與其他的環(huán)糊精手性柱相比，硝基苯醚環(huán)糊精配體含穩(wěn)定的醚鍵，不易水解；帶有吸電子的π-酸型配體，對堿性藥物阿替洛爾對映體有較高的分離選擇性；有序的介孔SBA-15 基質(zhì)渦流擴散小、傳質(zhì)快，為藥物對映體的快速監(jiān)測創(chuàng)造了條件。自制的環(huán)糊精柱比商品柱便宜得多，可降低測試成本，有良好的應(yīng)用前景。

圖1 二硝基苯醚β-環(huán)糊精手性固定相（NESP）及阿替洛爾的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of dinitrophenyl ether β-cyclodextrin-based chiral stationary phase （NESP）and atenolol

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

日本島津液相色譜系統(tǒng)包括LC-6A 泵、SPD-6AV 紫外-可見光檢測器，配有Rheodyne 7725 手動進樣閥及N-2000 色譜工作站（浙江大學(xué)智能信息工程研究所）；元素分析儀（Vario EL Ⅲ，德國Elementar 公司）；冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡（JSM-6701F，日本Jeol 公司）；電子天平（AR1140，美國Ohaus 公司）；超純水制備裝置（Milli-Q，美國Millipore 公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-100E，昆山市超聲儀器有限公司）。

有序介孔SBA-15（孔徑約25 nm，比表面積420 m2／g）、含炔基的SBA-15 和含疊基的2，4-二硝基苯醚化β-環(huán)糊精均為自制［16］。合成實驗使用的β-環(huán)糊精、3-氨丙基三乙氧基硅烷、丙炔酸、疊氮化鈉、2，4-二硝基氯苯、三嵌段聚合物P123、正硅酸乙酯（TEOS）均購于Sigma 公司；1，3，5-三甲苯（TMB）購于阿拉丁試劑上海公司；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）為分析純，使用前經(jīng)過氫化鈣除水減壓重蒸。外消旋的阿替洛爾標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma 公司；乙腈和甲醇為色譜淋洗劑（美國Tedia 公司）；三乙胺（TEA，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），用前重蒸一次；冰醋酸（HOAc，分析純，上海青析化工科技有限公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

4 種藥片:阿替洛爾片（25 mg／片，批號120801）由浙江萬馬藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；阿替洛爾片（50 mg／片，批號110901）由浙江亞太藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；阿替洛爾片（25 mg／片，批號120101）由天津市中央藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；阿替洛爾片（25 mg／片，批號130601）由山東平原制藥廠生產(chǎn)。

1.2 固定相的制備

參照本實驗室已報道的制備SBA-15 基質(zhì)和二硝基苯醚化環(huán)糊精鍵合SBA-15 手性固定相（NESP）的方法［16］制備。

類球形SBA-15 的制備:以P123 為模板，TMB為擴孔劑，TEOS 為硅源，在酸性條件下TEOS 水解，自組裝后轉(zhuǎn)入水熱反應(yīng)釜中靜態(tài)晶化，除模板后得到SBA-15。3 個不同批次制備的類球形SBA-15的孔徑為20 ～30 nm，粒徑為3 ～5 μm，比表面積為350 ～450 m2／g。采用有序介孔SBA-15 為基質(zhì)制備的色譜柱滲透性好，且有較好的色譜重現(xiàn)性。SBA-15 的掃描電鏡影像見圖2。

圖2 類球形SBA-15 的掃描電鏡影像Fig.2 Scanning electron micrograph （SEM）of spherical-like SBA-15

NESP 固定相的制備:將3.5 g 2，4-二硝基苯醚-疊氮基-β-環(huán)糊精溶于50 mL 干燥的DMF 中，攪拌下加入3.0 g 含炔基的SBA-15 硅膠，然后加入催化劑CuI（PPh3）（10%，物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)），在氮氣保護下于85 ℃反應(yīng)72 h，冷至室溫，過濾，固體用DMF 充分洗滌，然后用10% （v／v）EDTA 水溶液氧化和洗滌除去亞銅離子，再用水洗，最后用丙酮索氏提取24 h，真空干燥24 h，得到2，4-二硝基苯醚-β-環(huán)糊精手性固定相。

含炔基的SBA-15 硅膠的元素分析結(jié)果為C:0.85%，H:0.42%，N:0.13%；新制備的NESP 為C:2.96%，H:1.12%，N:0.43%。根據(jù)NESP 的碳含量計算鍵合量為0.068 μmol／m2。以丙酮為勻漿劑，甲醇為頂替劑，在恒壓（34.5 MPa）下，將手性固定相裝填入一根不銹鋼色譜柱中（150 mm ×4.6 mm）。新柱用甲醇和水反復(fù)沖洗，最后用流動相平衡，直至基線穩(wěn)定后進樣分析。

1.3 色譜方法和樣品的預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取一定量的外消旋的阿替洛爾標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制成400 μg／mL 的儲備溶液（每種對映體200 μg／mL），于冰箱中4 ℃避光保存。用流動相稀釋至所需濃度，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，超聲脫氣，直接進樣分析。流動相為乙腈／甲醇／冰醋酸／三乙胺（90∶10∶2.5∶3.0，v／v／v／v），使用前用G4砂芯漏斗過濾，超聲脫氣。流速為0.5 mL／min；柱溫為20 ℃；進樣量為20 μL；檢測波長為275 nm。死時間由1，3，5-三叔丁基苯測定，為3.4 min。

精確稱取10 片阿替洛爾藥片于研缽中，研磨成細小的粉末，準(zhǔn)確稱取一定量的樣品粉末（約含阿替洛爾總量10 mg），用甲醇超聲處理20 min，使藥片充分溶解，用甲醇定容至100 mL。經(jīng)0.45 μm 的有機濾膜過濾，作為待測溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的優(yōu)化

目前，文獻［11-13］報道阿替洛爾對映體通常采用涂覆型Chiralcel OD-H 纖維素類和鍵合型AD 直鏈淀粉類商品柱在正相色譜條件下拆分。環(huán)糊精類固定相可以同時用于正相和反相色譜，并以反相色譜居多，操作便利［17］。本實驗首先試用了甲醇／水、乙腈／水、甲醇／醋酸三乙胺緩沖溶液（TEAA）作為流動相的反相色譜體系，均未觀察到阿替洛爾對映體手性分離現(xiàn)象。后改用含不同體積比的乙腈／甲醇／冰醋酸／三乙胺流動相的極性有機溶劑模式［18］，成功地拆分了阿替洛爾對映體?？赡苁且驗榘⑻媛鍫柡邪被碱惤Y(jié)構(gòu)，手性碳與極性的羥基、氨甲基、苯氧基、酰胺基相連，氫鍵作用更有利于手性拆分，反相色譜流動相中大量的水會削弱環(huán)糊精配體與阿替洛爾之間的氫鍵作用，使得R／S-阿替洛爾與環(huán)糊精形成的配合物穩(wěn)定性差別很小，導(dǎo)致手性分離困難。而乙腈與水不同，它不是氫鍵給體，有利于溶質(zhì)和配體之間的氫鍵作用。

為了實現(xiàn)阿替洛爾對映體的良好分離，本實驗對流動相的組成進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)只用乙腈作流動相時溶質(zhì)無法被洗脫，當(dāng)加入適量的甲醇后溶質(zhì)才能被洗脫，甲醇的體積分?jǐn)?shù)對溶質(zhì)的保留有重要的影響。為了提高對映體的分離度（Rs），除添加甲醇外，還需添加適量的冰醋酸／三乙胺（HOAc／TEA）?；诃h(huán)糊精類固定相的前期實驗工作，我們發(fā)現(xiàn)流動相中添加等體積分?jǐn)?shù)（2%）的HOAc／TEA 時效果較好。在此比例下，隨著甲醇含量的提高，溶質(zhì)出峰加快，手性分離度也隨之改善；但進一步地提高甲醇的含量，分離度反而迅速下降。當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)保持在10%左右時分離度相對較好，可能是因為加入氫鍵給體甲醇，會影響溶質(zhì)與環(huán)糊精配體間的氫鍵作用，溶質(zhì)洗脫過快，在形成穩(wěn)定的包結(jié)物之前就已被洗脫，分離度變差。所以選擇甲醇的體積分?jǐn)?shù)為10%，進一步優(yōu)化HOAc 和TEA 改性劑的含量。從圖3 可以看出，當(dāng)固定TEA 加入HOAc 時，對映體的分離度先增大后減小，HOAc 體積分?jǐn)?shù)為2.5%時結(jié)果較好；當(dāng)固定HOAc 并加入3% （v／v）左右TEA 時，分離度達到最大值1.73，且分析時間在20 min 左右，有較高的分離效率。這可能是因為三乙胺降低了殘存硅醇羥基對堿性藥物（阿替洛爾）的影響，減小拖尾，提高柱效；加入冰醋酸可使堿性藥物部分質(zhì)子化，帶上正電荷，與環(huán)糊精端口存在離子-偶極作用和氫鍵作用，使R／S 對映體所形成的包結(jié)物的穩(wěn)定性差別變大，手性分離度增大。這與Yuan 等［19］發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象一致，他們也認為加入適量的冰醋酸有利于堿性藥物的手性分離。所以，優(yōu)化后的流動相的組成為:乙腈／甲醇／冰醋酸／三乙胺（90∶10∶2.5∶3.0，v／v／v／v）。

圖3 流動相中冰醋酸（HOAc）和三乙胺（TEA）的體積分?jǐn)?shù)對阿替洛爾分離度的影響Fig.3 Effect of the volume ratios of glacial acetic acid（HOAc）and triethylamine （TEA）in mobile phases on the resolution of atenolol enantiomers

2.1.2 流速的選擇

實驗中考察了流動相流速（0.3 ～1.0 mL／min）對分離度的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)流速較高時，溶質(zhì)被快速洗脫，與固定相的作用力不夠，分離度變差；而降低流速有利于分離，但分析時間延長。綜合考慮，選取流速為0.5 mL／min。

2.1.3 溫度的選擇

溫度的變化可能引起手性固定相手性空腔的構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致對映體選擇性發(fā)生改變［20］。本文考察了溫度對分離度和分析時間的影響，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的降低，阿替洛爾對映體的分離度變好，表明在一定的溫度范圍內(nèi)，對映體的拆分過程由焓控制［21］，手性分離應(yīng)在較低溫度下進行，但較低的柱溫會延長分析時間，不利于快速分析。因此，為兼顧分離度和分離速度，本實驗選擇柱溫為20 ℃。

2.1.4 檢測條件的選擇

通過標(biāo)準(zhǔn)品溶液的多波長掃描發(fā)現(xiàn)阿替洛爾在波長229 nm 和275 nm 處有兩個紫外吸收峰，前者吸收較強。由于流動相中的甲醇、三乙胺、冰醋酸在229 nm 處也有一定的吸收，而在275 nm 處只有溶質(zhì)有紫外吸收，故選定檢測波長為275 nm。

2.2 藥片中阿替洛爾對映體含量的測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

將外消旋阿替洛爾標(biāo)準(zhǔn)儲備液（400 mg／L）從冰箱中取出，恢復(fù)至室溫并搖勻，用甲醇適當(dāng)稀釋，得到 質(zhì) 量濃度分別為5.0、10.0、50.0、100、200 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。由于外消旋的阿替洛爾標(biāo)準(zhǔn)品含等量的R 和S 對映體，每個對映體的質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、25.0、50.0、100 mg／L。在上述優(yōu)化的色譜條件下分離和測定。實驗中經(jīng)對映體標(biāo)準(zhǔn)品保留時間對照，發(fā)現(xiàn)S 對映體先出峰。以峰面積為縱坐標(biāo)（y），阿替洛爾對映體的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，mg／L），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程如下。第 一 對 映 體（S）: y1＝ 78 472.45 x1＋35 935.01，r ＝0.999 2；第二對映體（R）:y2＝88 380.64x2＋49 375.05，r ＝0.998 9。

結(jié)果表明，阿替洛爾對映體在2.5 ～100 mg／L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。按3 倍信噪比（S／N ＝3）確定兩對映體的檢出限均為0.2 mg／L。標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖4。

圖4 阿替洛爾（100 mg／L）外消旋標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.4 Chromatogram of racemic atenolol standard solution

2.2.2 樣品提取溶劑的選擇

對水、甲醇、乙腈等提取溶劑進行比較，發(fā)現(xiàn)阿替洛爾在水中的溶解度較低，而在甲醇中有較好的溶解度，回收率較高，且重現(xiàn)性好。在極性有機模式下應(yīng)避免引入水，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

2.2.3 回收率試驗

采用加標(biāo)法測定樣品中阿替洛爾的回收率，每個對映體進行2 個加標(biāo)水平（5.0、25.0 mg／L）的試驗，每個水平連續(xù)測定5 次，以測得量的平均值與加入量之比計算平均回收率。結(jié)果見表1。

表1 藥片中S-阿替洛爾和R-阿替洛爾的回收率（n ＝5）Table 1 Recoveries of S-atenolol and R-atenolol in tablet （n ＝5）

2.2.4 精密度試驗

取50 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品經(jīng)過5 次重復(fù)測定，根據(jù)實驗結(jié)果計算得S-阿替洛爾與R-阿替洛爾保留時間的RSD 分別為0.49% 與0.53%，峰面積的RSD 分別為0.86%與0.92%。結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗

取50 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品，分別于配制后的0、6、12、24、48、72 h 測定，阿替洛爾兩對映體保留時間的 RSD 小 于0.92%，峰面 積 的 RSD 小 于1.37%。結(jié)果表明阿替洛爾在72 h 內(nèi)的化學(xué)穩(wěn)定性較好，適用于測定。

2.2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批次的阿替洛爾藥片2 號粉末等量樣品5 份，按1.3 項預(yù)處理方法制備供試品溶液，平行測定5 次，計算S-阿替洛爾與R-阿替洛爾保留時間的RSD 分別為0.63% 與0.88%，峰面積的RSD 分別為1.53% 與1.86%。結(jié)果顯示該方法有較好的重復(fù)性。

2.2.7 藥片中阿替洛爾對映體含量的測定

按1.3 節(jié)方法處理4 個不同廠家批次的阿替洛爾藥片，將所得溶液注入高效液相色譜儀中，測定對映體的峰面積，按上述回歸方程計算3 次測定的平均含量（見表2），樣品色譜圖見圖5。

表2 藥片中S-阿替洛爾和R-阿替洛爾含量的測定結(jié)果（n ＝3）Table 2 Results of S-atenolol and R-atenolol contents in tablet samples （n ＝3）

圖5 4 種藥片中阿替洛爾對映體的色譜圖Fig.5 Chromatograms of atenolol enantiomers in four kinds of tablets

3 結(jié)論

本文采用一種實驗室自制的二硝基苯醚β-環(huán)糊精鍵合有序介孔SBA-15 液相色譜手性固定相，在極性有機模式下實現(xiàn)了阿替洛爾對映體的快速拆分，建立了一種測定阿替洛爾片劑中對映體含量的新方法。該方法具有選擇性好、分析時間短、重現(xiàn)性好、測試成本較低等優(yōu)點，在手性藥物質(zhì)量監(jiān)測和相關(guān)藥代動力學(xué)研究方面有良好的應(yīng)用前景。

［1］ You Q D，Lin G Q. Chiral Drugs Research and Application.Beijing:Chemical Industry Press（尤啟冬，林國強. 手性藥品研究與應(yīng)用. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社），2004:25

［2］ Brown R A，Ilg K J，Chen A F，et al. Eur J Pharmacol，2002，442（3）:241

［3］ Giachetti C，Tenconi A，Canali S，et al. J Chromatogr B，1997，698（1／2）:187

［4］ Biswas N M，Gupta R S，Chattopadhyay A，et al. Reprod Toxicol，2001，15（6）:699

［5］ Chen L R. Chiral Separation by High Performance Liquid Chromatography. Beijing:Science Press （陳立仁. 液相色譜手性分離. 北京:科學(xué)出版社），2006:3

［6］ Ward T J，Baker B A. Anal Chem，2008，80（12）:4363

［7］ Park J M，Park J H. J Chromatogr A，2014，1339:229

［8］ Chu Y B，Jiang W Q，Cui F X，et al. Chinese Journal of Chromatography （初永寶，蔣文強，崔鳳霞，等. 色譜），2003，21（2）:138

［9］ Bhushan R，Arora M. Biomed Chromatogr，2003，17（4）:226

［10］ Zhou C J，He D L. Physical Testing and Chemical Analysis Part B:Chemical Analysis （周采菊，賀德龍. 理化檢驗:化學(xué)分冊），2010，46（2）:184

［11］ Agustian J，Kamaruddin A H，Aboul-Enein H Y. Chirality，2012，24（5）:356

［12］ Zhang J H，Wang R，Xie H，et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis （張娟紅，王榮，謝華，等. 藥物分析雜志），2012，32（10）:1741

［13］ Mikuldas H，Cepanec I，Sporec A，et al. J Sep Sci，2005，28（3）:251

［14］ EI Deeb S. Chromatographia，2010，71（9／10）:783

［15］ Wang Y，Ong T T，Li L S，et al. J Chromatogr A，2009，1216（12）:2388

［16］ Li L S，Zhou R D，Cheng B P，et al. Journal of Nanchang University:Natural Science （李來生，周仁丹，程彪平，等. 南昌大學(xué)學(xué)報:理科版），2013，37（2）:145

［17］ Soukup R J，Rozhkov R V，Larock R C，et al. Chromatographia，2005，61（5／6）:219

［18］ Armstrong D W，Tang Y B，Chen S S，et al. Anal Chem，1994，66（9）:1473

［19］ Yuan R J，Wang Y，Ding G S. Anal Sci，2010，26（9）:943

［20］ Rojkovicova T，Lehotay J，Mericko D，et al. J Liq Chromatogr Rel Technol，2004，27（16）:2477

［21］ Sajewicz M，Pietka R，Kowalska T. J Liq Chromatogr Rel Technol，2005，28（16）:2499