馮志明，蔡俊，李旭紅，李其華，曹小妹

(1.湖南師范大學化學生物學及中藥分析省部共建教育部重點實驗室，長沙 410081；2.中南大學湘雅三醫(yī)院，長沙 410013)

化學發(fā)光免疫分析是利用酶催化的化學發(fā)光進行定量分析的光化學方法。相比傳統(tǒng)的放射免疫分析，化學發(fā)光免疫分析不需昂貴的實驗設備，無放射性污染，操作簡便。與酶聯免疫定性比色分析比較，化學發(fā)光免疫分析不僅靈敏度高，且能夠進行定量分析與檢測，應用前景廣闊。

辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)是常用的抗體標記酶，因其具有高轉換系數、適應性廣和相對分子質量小等特點而廣泛應用于化學發(fā)光免疫分析［1］。魯米諾(luminol)是HRP催化氧化發(fā)光的常用底物。當不使用增強劑時，魯米諾體系的發(fā)光時間短、發(fā)光強度小、檢測靈敏度低。加入增強劑，可使發(fā)光強度提高，發(fā)光持續(xù)時間延長，提高了信噪比和靈敏度［2］。文獻報道的用于HRP酶促化學發(fā)光的增強劑雖然比較多，但價廉高效的增強劑仍值得探索［3］。

筆者選取價廉易得的商品酚酞為原料合成酚酞啉，探討了酚酞啉對HRP–Luminol–H2O2化學發(fā)光的增強特性以及用于HRP定量分析的可行性。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

酸度計：pHS–25C型，上海精密科學儀器有限公司；

發(fā)光光度計：LKB–1250型，瑞典LKB公司；酚酞啉：參照文獻［4］合成，略有改進；

魯米諾和辣根過氧化物酶［RZ(A403／A275)～3.0］：美國Sigma-aldrich公司；

辣根過氧化物酶標記鼠抗人甲胎蛋白單克隆抗體包被IgG(Anti-AFP–HRP)：長沙贏潤生物技術有限公司；

實驗所用其它化學試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

將適量的10 mmol／L酚酞、對碘酚或酚酞啉溶液(用pH 8.5 Britton-Robinson 緩沖液配制)、辣根過氧化物酶溶液(用pH 8.5 Britton-Robinson緩沖液稀釋至1×10–6g／L)和10 mmol／L魯米諾溶液(1.77 mg魯米諾溶于1 mL pH 8.5 Britton-Robinson緩沖液)充分混合后，加入30.0 mmol／L H2O2溶液到測定管中，在發(fā)光光度計中測定發(fā)光強度。

2 結果與討論

2.1 增強劑對HRP–Luminol–H2O2酶促發(fā)光的增強作用

在HRP–Luminol–H2O2反 應 體 系(1.0×10–7g／L HRP，3 mmol／L H2O2，1.5 mmol／L Luminol，pH 8.5)中，無增強劑時，發(fā)光強度低，且持續(xù)時間短。加入酚酞、對碘酚和酚酞啉(終濃度均為0.5 mmol／L)，均可顯著提高反應體系的發(fā)光強度。對碘酚和酚酞啉不僅能顯著增強HRP酶催化的化學發(fā)光強度，而且在30～60 s發(fā)光強度達到峰值后衰減慢，持續(xù)發(fā)光可達20～30 min(見表1)。酚酞也可提高反應體系的發(fā)光強度，但體系發(fā)光強度達到峰值后衰減較快。結果表明，酚酞啉和對碘酚對HRP–Luminol–H2O2反應體系的發(fā)光具有相似顯著的增強作用，克服了HRP–Luminol–H2O2反應體系瞬時發(fā)光、不易準確測量和發(fā)光強度低等缺點［5］。

表1 增強劑對HRP–Luminol–H2O2酶促發(fā)光的增強效應

關于HRP–Luminol–H2O2反應體系，一般認為HRP催化過氧化氫產生活性氧自由基，活性氧自由基再激發(fā)發(fā)光劑魯米諾形成激發(fā)態(tài)魯米諾自由基，魯米諾自由基再釋放光子返回基態(tài)［6–8］。實驗證明，在HRP–Luminol–H2O2反應體系中加入酚酞啉后，其最大發(fā)射波長仍為425 nm處，與文獻報道HRP–Luminol–H2O2反應體系發(fā)光光譜基本相同。說明酚酞啉沒有改變HRP酶促發(fā)光反應的歷程，可能是酚酞啉更容易形成穩(wěn)定的自由基，起到能量傳遞中間體的作用，從而避免活性氧自由基之間的相互滅活，使酶促發(fā)光反應溫和且持續(xù)。

HRP酶促反應的發(fā)光強度隨時間變化而改變，啟動反應后在30 s左右達到峰值，然后緩慢衰減。在實驗條件下，選擇啟動反應后30 s時記錄發(fā)光強度較為合適，發(fā)光值較高且誤差小。

2.2 酸度對酚酞啉增強的HRP–Luminol–H2O2化學發(fā)光的影響

在HRP–Luminol–H2O2反 應 體 系(1.0×10–7g／L HRP，1.5 mmol／L Luminol，0.5 mmol／L酚酞啉，3.0 mmol／LH2O2)中，通過改變緩沖液的pH值改變反應體系的酸度，在pH 7.0～9.5范圍內測定反應啟動后30 s時的發(fā)光強度，結果見表2。

表2 酸度對酚酞啉增強的HRP–Luminol–H2O2酶促發(fā)光的作用

由表2可知，酸度對酚酞啉增強的HRP–Luminol–H2O2化學發(fā)光影響較大。相對發(fā)光強度在pH 8.5時達最大值，pH值低于8.5時衰減迅速，pH 8.5～9.5時緩慢衰減。pH值過低，不利于底物魯米諾自由基的生成；pH值過高，辣根過氧化物酶的活性受限。實驗選擇pH 8.5較為合適，靈敏度高。

2.3 酚酞啉的濃度對HRP–Luminol–H2O2化學發(fā)光的影響

在HRP–Luminol–H2O2反 應 體 系(1.0×10–7g／L HRP，1.5 mmol／L Luminol，0.5 mmol／L酚酞啉，3.0 mmol／L H2O2，pH 8.5)中依次加入不同劑量的酚酞啉，記錄反應啟動后30 s時的發(fā)光強度，結果見表3。

表3 酚酞啉的濃度對HRP–Luminol–H2O2酶促發(fā)光的作用

由表3可知，酚酞啉濃度在0.5～1.0 mmol／L范圍內有較好的增強效果。在HRP質量濃度為1.0×10–7g／L時，加入0.5 mmol／L酚酞啉即可獲得理想的增強效果，酚酞啉濃度過高反而不利于反應體系的發(fā)光。

2.4 標準曲線、精密度和檢出限

HRP采用0.1% BSA溶液應用對數稀釋法，質量濃度依次為1 600，800，400，200，100，50，25，10，5 pg／mL。在HRP–Luminol–H2O2反應體系(適量的HRP，1.5 mmol／L Luminol，0.5 mmol／L酚酞啉，3.0 mmol／L H2O2，pH 8.5)中，依次遞增辣根過氧化物酶含量，啟動反應后30 s時記錄發(fā)光值(見圖1)。

圖1 辣根過氧化物酶濃度對HRP–Luminol–H2O2酶促發(fā)光的作用

在發(fā)光體系中加入酚酞啉，酶含量在5～800 pg／mL范圍內(免疫分析常用檢測范圍)HRP濃度c與相對發(fā)光強度I顯示良好的線性關系，其線性回歸方程為lgI =1.15lgc+0.82，線性相關系數r=0.96。

對空白溶液進行10次平行測定，以測定結果的3倍標準偏差除以校準曲線斜率，求得方法的檢出限為1.25 pg／mL。

2.5 精密度試驗

取HRP樣品，按照實驗方法重復測定不同濃度的HRP樣品，進行精密度試驗，觀察批內批間的變異系數，結果見表4。

表4 精密度試驗結果(n=10)

由表4可知，批內相對標準偏差為2.8%～5.1%，批間的相對標準偏差為5.8%～8.1%，說明方法具有良好的精密度。

2.6 回收試驗

取HRP樣品，按照實驗方法測定，再分別加入不同體積的100 pg／mL HRP標準工作溶液，進行加標回收試驗，結果見表5。由表5可知，HRP加標回收率在93.5%～96.2%之間，說明方法具有較高的準確度。

表5 加標回收試驗結果

2.7 在HRP標記的AFP檢測中的應用

HRP是常用的抗體標記酶，用于增強化學發(fā)光系統(tǒng)中具有樣品用量少、發(fā)光強度大、反應時間短、無污染等優(yōu)點，在腫瘤標志物臨床檢測等免疫分析中應用廣泛［9］。在發(fā)光反應體系中選擇臨床檢驗應用廣泛的辣根過氧化物酶標記鼠抗人甲胎蛋白單克隆抗體包被IgG代替HRP，觀察酚酞啉在其檢測中的初步應用。

參照2.4中的測定方法，用Anti–AFP–HRP代替HRP，AFP質量濃度依次為1 600，800，400，100，50，10 ng／mL。AFP含量在10～1 600 ng／mL范圍內線性關系良好，其線性回歸方程為lgI=1.14lgc+0.78，線性相關系數r=0.98。由于AFP上標記的HRP相對較少，因此其線性范圍略寬于純的HRP。

3 結語

在HRP–Luminol–H2O2反應體系中，增強劑酚酞啉的使用從其穩(wěn)定性及增強發(fā)光作用等都顯示出良好的特性，方法具有良好的精密度和準確度。與其它酚類有機增強劑［10–12］不同，酚酞啉合成與純化簡便，價廉高效，使用簡便，可以用于HRP及其標記物的化學發(fā)光定量分析。

［1］Kamidate T，Komatsu K，Tani H，et al. Direct determination of horseradish peroxidase encapsulated in liposomes by using luminol chemiluminescence［J］. Anal Sci，2008，24(4): 477–481.

［2］Minekawa T，Ohkuma H，Abe K，et al. Development of ultra-high sensitivity bioluminescent enzyme immunoassay for hepatitis B virus surface antigen using firefly luciferase［J］. Luminescence，2009，24(6): 394–399.

［3］Kamidate T，Maruya M，Tani H，et al. Application of 4-iodophenolenhanced luminol chemiluminescence to direct detection of horseradish peroxidase encapsulated in liposomes［J］. Anal Sci，2009，25(9): 1 163–1 166.

［4］Kolthoff I M，Lehmicke D J. Polarographic behavior of phenolphthalein［J］. J Am Chem.Soc，1948，70(5): 1 879–1 885.

［5］Sánchez F G，Díaz A N，Bracho V，et al. Automated determination of asulam by enhanced chemiluminescence using luminol／peroxidase system［J］. Luminescence，2009，24(6): 448–452.

［6］Vladimirov Y A，Proskurnina E V. Free radicals and cell chemiluminescence［J］. Biochemistry (Moscow)，2009，74(13): 1 545–1 566.

［7］Rájecky M，Lojek A，Cí? M. Differentiating between intra-and extracellular chemiluminescence in diluted whole-blood samples［J］. International Journal of Laboratory Hematology，2012，34(2): 136–142.

［8］Alpeeva I S，Sakharov I U. Luminol–hydrogen peroxide chemiluminescence produced by sweet potato peroxidase［J］. Luminescence，2007，22(2): 92–96.

［9］Yang X Y，Guo Y S，Bi S，et al. Ultrasensitive enhanced chemiluminescence enzyme immunoassay for the determination of α-fetoprotein amplified by double-codified gold nanoparticles labels［J］. Biosensors and Bioelectronics，2009，24(8): 2 707–2 711.

［10］Xin T B，Chen H，Lin Z，et al. A secondary antibody format chemiluminescence immunoassay for the determination of estradiol in human serum［J］. Talanta，2010，82(4): 1 472–1 477.

［11］Ahmed S，Kishikawa N，Ohyama K，et al. An ultrasensitive and highly selective determination method for quinones by highperformance liquid chromatography with photochemically initiated luminol chemiluminescence［J］. J Chromatogr A，2009，1216(18): 3 977–3 984.

［12］范順利，屈芳，林金明. H2O2–魯米諾–熒光素鈉–K2CO3高靈敏化學發(fā)光法測定二氧化碳［J］.化學學報，2006，64(18): 1 876–1 880.