張彥妮，陳素波

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

報春花科植物共22屬，約1 000種，其中點地梅屬(Androsace)約有120種，分布于北半球溫帶，其中青藏高原地區(qū)和歐洲的阿爾卑斯山脈是該屬的兩個分布中心。中國有73個種7個變種，主要分布在青藏高原，適應(yīng)高緯度地區(qū)生長，有部分種類分布在西北至內(nèi)蒙古、東北以及秦嶺以南各省區(qū)［1］。

目前，點地梅屬植物的相關(guān)研究主要集中在化學(xué)成分的提取、藥理作用、臨床方面。已經(jīng)從該屬中提取了黃酮類化合物［2-4］和11個三萜皂苷類成分［5-7］;在北點地梅(A.septentrionalis)中發(fā)現(xiàn) 11-cishexadecenoic acid 和 9-cis，12-cishexade-cadienoic acid兩種植物中罕見的脂肪酸［8］。點地梅屬的藥理作用主要體現(xiàn)在能顯著提高人肝癌細(xì)胞的抗增殖活性［9］、抑制人肺癌細(xì)胞A549、肝癌細(xì)胞BEL-7402和胃癌細(xì)胞 SGC7901的增殖等［10］。在臨床方面，主要用于治療咽喉炎和慢性咽喉腫痛［11］。所以點地梅屬植物具有重要的藥用價值。

懸浮培養(yǎng)作為一種植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，主要是指愈傷組織在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)過程［12］，主要應(yīng)用于獲得再生植株和細(xì)胞內(nèi)的次生代謝物質(zhì)。長葉點地梅(A.longifolia)又稱矮葶點地梅，為點地梅屬多年生草本，葉叢生，線性，灰綠色，花冠白色，喉部紫紅色，花朵嬌小，花期為5月，是東北地區(qū)難得的早春花卉，更是一種不可多得的富有野趣的草坪植物和優(yōu)良地被植物。目前，僅見通過葉片對長葉點地梅進行愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的報道［13］，要使其快速地應(yīng)用于園林綠化，就需要有大量的苗源。本研究以長葉點地梅愈傷組織作為試驗材料，對其不同激素條件下細(xì)胞生長、培養(yǎng)液pH值、電導(dǎo)率的變化、對碳源的消耗等研究，以期為其液體懸浮培養(yǎng)及原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)再生體系的建立提供一定的參考，同時為點地梅屬植物利用懸浮培養(yǎng)進行次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在培養(yǎng)基 MS+1.0 mg·L－1，2，4-D+0.2 mg·L－16-BA上篩選出的淡綠色、疏松的愈傷組織。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對懸浮細(xì)胞生長的影響 將1.0 g(依據(jù)預(yù)試驗結(jié)果)淡綠色、疏松愈傷組織分別接種于加有不同濃度2，4-D(0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L－1)、或 6-BA(0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L－1)的盛有 50 mL MS 液體培養(yǎng)基(滅菌前pH為5.4)的100 mL三角瓶中，于搖床上培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速100 r·min－1)，培養(yǎng)溫度25℃，光周期16 h/8 h。比較激素種類或濃度對細(xì)胞干質(zhì)量的影響。每3 d測一次細(xì)胞干質(zhì)量，每組重復(fù)3次，取平均值測至30 d。以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞干質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制長葉點地梅的愈傷懸浮培養(yǎng)的生長曲線。

1.2.2 不同蔗糖濃度下愈傷組織對碳源的消耗規(guī)律將1.0 g淡綠色、疏松愈傷組織接種于蔗糖濃度分別為1%、2%、3%、4%的50 mL MS液體培養(yǎng)基(添加上面試驗選出的最佳激素濃度，滅菌前pH為5.4)中，于搖床上培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速100 r·min－1)，培養(yǎng)溫度25℃，24 h光照下培養(yǎng)。利用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖，以蒽酮法測定蔗糖、果糖、葡萄糖［14］。

1.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對細(xì)胞生長的影響 將1.0 g淡綠色、疏松愈傷組織接種于加有上面試驗篩選出的最佳濃度的激素和蔗糖的50 mL MS液體培養(yǎng)基(滅菌前pH值為5.4)中，于不同轉(zhuǎn)速(設(shè)為75、85、95、105、115、125 r·min－1)的搖床上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照下培養(yǎng)。12 d后(依據(jù)預(yù)試驗結(jié)果)測細(xì)胞干質(zhì)量。

1.2.4 培養(yǎng)液pH值、電導(dǎo)率及干質(zhì)量的測定 每100 mL三角瓶盛有50 mL培養(yǎng)液(上面試驗篩選出的最佳MS液體培養(yǎng)基，滅菌前pH為5.4)，接種1.0 g淡綠色、疏松愈傷組織，培養(yǎng)溫度25℃，24 h光照下培養(yǎng)。定期測定培養(yǎng)液pH、電導(dǎo)率和細(xì)胞干質(zhì)量。

pH 測定:每隔3 d 取樣一次，1 000 r·min－1離心4 min，用精密pH計測定上清液酸堿度，每個試驗重復(fù)3次，取平均值。

電導(dǎo)率的測定:每隔3 d取一次懸浮培養(yǎng)的長葉點地梅培養(yǎng)液，過濾所得培養(yǎng)液用電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率，單位為 ms·cm－1。

干質(zhì)量的測定:將三角瓶中的懸浮細(xì)胞用蒸餾水將殘留的細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗干凈，再用濾紙將水分吸干，將細(xì)胞于60℃烘箱中烘干72 h后稱其干質(zhì)量。每3 d測一次細(xì)胞干質(zhì)量，每次重復(fù)3組，取平均值測至30 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對懸浮細(xì)胞生長的影響

不同濃度的6-BA對懸浮細(xì)胞的生長均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖1)。在前9 d，各個濃度的6-BA對細(xì)胞生長影響差異不大，低濃度(0.1 mg·L－1)6-BA中細(xì)胞干質(zhì)量達到峰值所需時間較短(9 d)，但數(shù)值小于其他3個濃度下的細(xì)胞干質(zhì)量。當(dāng)6-BA的濃度為0.3 mg·L－1時，細(xì)胞干質(zhì)量值最大(0.153 g)，細(xì)胞的生長最旺盛，下降速度較為緩慢。而在6-BA濃度升至0.4 mg·L－1時，細(xì)胞干質(zhì)量有所下降，而且在達到最高峰時，細(xì)胞干質(zhì)量急劇下降，可能是由于高濃度的細(xì)胞分裂素加速了細(xì)胞死亡［15］的原因。

不同2，4-D濃度對細(xì)胞生長的影響呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖1)。在培養(yǎng)9 d時，2，4-D濃度為0.4 mg·L－1時細(xì)胞干質(zhì)量開始下降，但下降速度較為緩慢。在12 d時，其他3個濃度下的細(xì)胞干質(zhì)量均達到峰值，但0.6 mg·L－1時 2，4-D 的細(xì)胞干質(zhì)量最大(0.14 g)，1.0 mg·L－1時細(xì)胞干質(zhì)量最低，說明2，4-D濃度過高時，會抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，長葉點地梅懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的最佳激素為0.3 mg·L－16-BA，應(yīng)在12 d之前獲取細(xì)胞材料，以保持良好的細(xì)胞分裂能力。

2.2 不同蔗糖濃度下對碳源的消耗規(guī)律

在MS液體培養(yǎng)基中加入0.3 mg·L－16-BA，培養(yǎng)12 d時獲取新鮮細(xì)胞測量干質(zhì)量。液體培養(yǎng)基中的蔗糖首先被迅速水解為等分子的葡萄糖和果糖，然后被細(xì)胞吸收利用(圖2)。當(dāng)蔗糖濃度為1%時，蔗糖迅速水解，在3－12 d期間葡萄糖和果糖等活性糖的含量不斷減少，培養(yǎng)12 d時，幾乎被完全利用，易使長葉點地梅懸浮細(xì)胞處于碳源饑餓狀態(tài)，不能充分滿足甚至限制細(xì)胞的生長。隨著蔗糖濃度的增加，當(dāng)濃度達到3%時，在懸浮培養(yǎng)0－3 d，細(xì)胞生長處于遲滯期，蔗糖水解為活性多糖積累較慢，進入6－12 d，細(xì)胞生長處于對數(shù)期，活性糖的積累較多，之后下降緩慢，但到30 d時活性糖的量仍很多，說明培養(yǎng)基中的碳源能夠很好地供細(xì)胞生長，當(dāng)蔗糖濃度達到4%時，活性糖的積累量減少，蔗糖水解速度減慢。

過低和過高的蔗糖濃度都不利于活性多糖的積累，較低或較高的蔗糖濃度，影響培養(yǎng)液的滲透壓，致使細(xì)胞增殖率較低，這可能與長葉點地梅的細(xì)胞內(nèi)還原糖的積累和代謝水平有關(guān)。當(dāng)蔗糖濃度為2%時，細(xì)胞生長狀態(tài)最佳，干質(zhì)量值接近于蔗糖濃度3%的干質(zhì)量值(圖3A)，因此，總體來說，當(dāng)接種量為1 g時，長葉點地梅細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最佳蔗糖濃度為2%。

2.3 搖床轉(zhuǎn)速對細(xì)胞生長的影響

當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為105 r·min－1時，細(xì)胞干質(zhì)量最大(0.150 g);轉(zhuǎn)速為 125 r·min－1時，細(xì)胞部分死亡，三角瓶中的液體培養(yǎng)基變渾濁，干質(zhì)量有所下降(圖3B)。所以，長葉點地梅愈傷懸浮培養(yǎng)的最佳搖床轉(zhuǎn)速為 105 r·min－1。

圖1 不同6-BA和2，4-D濃度對懸浮細(xì)胞干質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of different 6-BA and 2，4-D concentrations on cell dry weight in suspension cultures

圖2 不同起始蔗糖濃度下細(xì)胞外各種糖的變化Fig.2 Concentration changes of different sugar outside the cell in cell suspension cultures at various initial sucrose concentrations

圖3 不同蔗糖濃度(A)和搖床轉(zhuǎn)數(shù)(B)對細(xì)胞干質(zhì)量的影響Fig.3 Effects of sucrose concentrations(A)and shaker rate(B)on the cell dry weight in cell suspension cultures

2.4 培養(yǎng)液pH及電導(dǎo)率、細(xì)胞干質(zhì)量的測定

MS液體培養(yǎng)基中附加2%蔗糖、0.3 mg·L－16-BA，接種1 g愈傷組織，搖床轉(zhuǎn)速為105 r·min－1，定期測定培養(yǎng)液pH及電導(dǎo)率，12 d后測細(xì)胞干質(zhì)量。

在整個生長周期中，長葉點地梅細(xì)胞培養(yǎng)液的pH呈先下降后緩慢上升的變化趨勢(圖4A)，曲線近似“V”字形變化。滅菌前培養(yǎng)基的pH為5.4，可能由于滅菌過程中培養(yǎng)基中的水分散失的原因，滅菌后pH下降到5.32。在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的0－12 d，細(xì)胞生長處于延滯期，pH由起始的5.32降至4.01，在13－21 d時，pH開始回升，之后pH雖呈波動性變化，但總體上基本保持穩(wěn)定，可能細(xì)胞自身的調(diào)節(jié)能力起到一定作用，這種調(diào)節(jié)作用是有限的，超過這個限度就會對細(xì)胞分裂生長起到抑制作用，不利于細(xì)胞生長。一方面pH的“V”形變化可能與植物細(xì)胞對離子的吸收先后有關(guān)，植物細(xì)胞優(yōu)先利用培養(yǎng)液中的NH4+，使pH迅速下降，隨后再利用NO3－，導(dǎo)致pH逐漸回升，另一方面細(xì)胞在從培養(yǎng)液中吸收營養(yǎng)物質(zhì)的同時，還會釋放出一些代謝產(chǎn)物，如生物堿、氨基酸等，這些都會導(dǎo)致培養(yǎng)液pH呈波動性變化。由于pH值的升降影響了細(xì)胞質(zhì)膜的電位、通透性及細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換，從而控制了細(xì)胞的生長［16］。

電導(dǎo)率可在一定程度上反映出液體培養(yǎng)基中的離子總量，因此，從溶液電導(dǎo)率的升降程度可以了解營養(yǎng)物質(zhì)消耗的情況及細(xì)胞生長狀態(tài)。在0－15 d，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，溶液的電導(dǎo)率呈下降趨勢。在15 d左右，培養(yǎng)液的電導(dǎo)率達到最低(圖4B)。

圖4 不同時期細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液pH值(A)和電導(dǎo)率(B)變化Fig.4 Variations of p H values(A)and conductivity(B)in cell suspension cultures during different cell growing period

長葉點地梅細(xì)胞懸浮生長的干質(zhì)量曲線近似“S”形，開始的0－3 d，細(xì)胞生長處于遲滯期，分裂速度較慢，加之細(xì)胞對新環(huán)境的適應(yīng)，可能有小部分死亡，細(xì)胞干質(zhì)量下降;4－12 d細(xì)胞處于對數(shù)生長期，生長速度和細(xì)胞數(shù)量大幅度提高;12 d以后，細(xì)胞干質(zhì)量開始呈下降趨勢，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是蔗糖的消耗和次級代謝物質(zhì)中有害物質(zhì)的積累，不利于細(xì)胞生長，導(dǎo)致細(xì)胞開始死亡，在30 d時，細(xì)胞已經(jīng)大量死亡，干質(zhì)量下降(圖5)。因此，長葉點地梅懸浮細(xì)胞的最佳獲得時間為12 d左右。

圖5 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)不同生長時期細(xì)胞干質(zhì)量的變化Fig.5 Changes of cell dry weight in suspension cultures during cell growing period

3 討論

植物材料在同等條件下的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)不同。在液體培養(yǎng)基中細(xì)胞能與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積更充分，但氣體交換能力相對固體培養(yǎng)較弱，因此，對愈傷組織質(zhì)量、接種量、激素濃度、蔗糖濃度、搖床轉(zhuǎn)速等要求不同。本研究表明，低濃度碳源雖有利于加快細(xì)胞增殖的速度，但不能使細(xì)胞達到最佳狀態(tài)，高濃度的碳源會抑制細(xì)胞的增殖，長葉點地梅愈傷懸浮培養(yǎng)的最佳蔗糖濃度為2%。不同的植物種類懸浮培養(yǎng)所用的激素種類和濃度差異很大，夜香牛(Vernonia cinerea)在基本培養(yǎng)基中加3%的蔗糖、1.0 mg·L－1NAA 和0.1 mg·L－1BA時培養(yǎng)4周后獲得的生物量最高(9.85 g)［17］。本研究比較了 2，4-D 和 6-BA，0.3 mg·L－1的6-BA更有利于細(xì)胞增殖。新鮮愈傷在液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)時，細(xì)胞的分散程度與搖床的轉(zhuǎn)速有關(guān)，搖床的轉(zhuǎn)速也會對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，轉(zhuǎn)速太慢細(xì)胞不能夠形成均勻的分散系，轉(zhuǎn)速過快搖床產(chǎn)生的剪切力會破壞細(xì)胞，因此，適宜的轉(zhuǎn)速也是影響細(xì)胞生長的因素之一。但不同植物細(xì)胞對搖床轉(zhuǎn)速要求不同，如石榴懸浮培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速110 r·min－1［18］。搖床的轉(zhuǎn)速影響了細(xì)胞增殖，但相對其他因素，其作用效果很小，一般轉(zhuǎn)速控制在90～120 r·min－1［19］，但有的植物要求轉(zhuǎn)速較低，如野生草珊瑚(Sarcandra globra)的懸浮細(xì)胞在100 r·min－1速度下幾乎不能存活，最佳的搖床轉(zhuǎn)速為40 r·min－1［20］。長葉點地梅細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最佳搖床轉(zhuǎn)速為 105 r·min－1。

長葉點地梅懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的研究為進一步完善點地梅再生體系建立、次生代謝生產(chǎn)和逆境因子研究等奠定了基礎(chǔ)，同時，為利用生物工程技術(shù)從點地梅屬植物中獲取有效藥用成分、緩解天然資源壓力提供新的研究思路。

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