王良發(fā)，張守林，盧瑞乾，李長建，李風章，王 靜，張素芬 (河南省鶴壁市農(nóng)業(yè)科學院玉米研究中心，河南鶴壁458030)

玉米是人類重要食物之一，在過去的幾十年里，傳統(tǒng)雜交育種為人類糧食生產(chǎn)作出了巨大貢獻。但隨著人口數(shù)量的劇增，傳統(tǒng)育種技術(shù)已不能滿足人類對食物、能源等的需求。轉(zhuǎn)基因技術(shù)因能在較短時間內(nèi)生產(chǎn)人們所需的生物性狀而迅速發(fā)展。據(jù)專家預測，到2030年，全球50%的農(nóng)產(chǎn)品將由轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供［1］。筆者就玉米轉(zhuǎn)基因在抗除草劑、抗蟲、抗病、抗鹽堿等方面的成果進行了回顧，以期為我國玉米分子育種研究提供參考。

1 技術(shù)回顧

1.1 玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù) 將外源 DNA片段轉(zhuǎn)入玉米細胞中主要有3種方法:①載體介導轉(zhuǎn)化法，如農(nóng)桿菌介導法;②DNA直接導入法，如基因槍法;③種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化法，如花粉管通道法。

1983年，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法成功運用于雙子葉植物煙草，直到1996年，ISHIDA等［2］構(gòu)建超雙元載體，以根癌農(nóng)桿菌為媒介轉(zhuǎn)化玉米自交系A(chǔ)188的幼胚，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法得以在玉米育種中廣泛運用。

基因槍法是將外源DNA包裹在微小的金?；蜴u粒表面，然后在高壓放電所產(chǎn)生的推力下高速微粒射入受體細胞或組織，使之導入細胞?；驑尫ň哂胁皇苁荏w類型限制，可同時轉(zhuǎn)化多個基因，轉(zhuǎn)化率高的特點。

1988年，周光宇等［3］提出并發(fā)展了花粉管通道法，該法的主要原理是授粉后使外源基因能沿花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞。該法操作簡單，無需建立愈傷組織誘導，省時省力，不受植株基因型限制。

1.2 標記基因 作物轉(zhuǎn)基因所應(yīng)用的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)只能使一小部分細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，因此在導入目的基因的同時還要導入標記基因，賦予轉(zhuǎn)化體特定標記以便于識別和鑒定［4］。部分常用于轉(zhuǎn)基因玉米的標記基因見表1。

表1 常用于轉(zhuǎn)基因玉米中的標記基因

2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米中的應(yīng)用

2.1 抗除草劑 將抗除草劑耐性引入玉米是增加對除草劑選擇及安全性的一種新途徑，也是一種高效、低成本、無公害的控制雜草的手段。

1996年美國孟山都公司最先注冊了抗草甘膦(農(nóng)達)的玉米品種，1997年美國孟山都公司已將EPSPS轉(zhuǎn)基因玉米應(yīng)用于大田試驗。SR玉米是BASF公司開發(fā)的抗除草劑玉米，對除草劑具有高度耐受性，在出芽后噴施可防治大多數(shù)禾本科雜草。在抗除草劑基因中以來源于吸水鏈霉菌的(Streptomyces hygroscopicus)Bar基因應(yīng)用最廣且最成功。

近年來，研究人員培育出了一大批抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米品種。如抗咪唑啉酮玉米、抗稀禾定玉米、抗Liberty玉米、抗Poast玉米、抗草銨膦玉米、抗草丁膦玉米等。

2.2 抗蟲 蟲害是制約玉米生產(chǎn)的一大因素。傳統(tǒng)的化學殺蟲劑不僅殺死害蟲，還殺死了害蟲的天敵，造成生態(tài)平衡破壞和環(huán)境污染。轉(zhuǎn)基因玉米是代替殺蟲劑的更有效方法。

由于玉米螟泛濫，從蘇云金桿菌分離出的Bt毒蛋白基因就是針對這類鱗翅目昆蟲的，Bt毒蛋白在昆蟲幼蟲的腸道內(nèi)微堿性條件下，經(jīng)蛋白酶水解，轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘远嚯姆肿?，可與敏感昆蟲腸道上表皮細胞表面特異受體相互作用，擾亂細胞的滲透平衡，引起細胞腫脹甚至裂解，從而導致幼蟲停止進食最終死亡。隨后，針對鞘翅目、雙翅目的基因相繼發(fā)現(xiàn)。目前市面上已有好幾種Bt基因出售。

我國從1989年開始轉(zhuǎn)基因抗蟲育種。中國農(nóng)業(yè)大學玉米抗蟲轉(zhuǎn)基因研究課題組將Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入玉米獲得了有抗蟲性的轉(zhuǎn)化體，并在后代中分離出了正常遺傳的家系［5］。王國英等［6］成功地利用基因槍法把Bt基因轉(zhuǎn)移到玉米幼胚中，再生植株中CryIA基因得到表達。王景雪等［7］用花粉管通道法分別將幾丁質(zhì)酶基因和Bt基因?qū)胗衩住?/p>

由于長時間的單一種植，一些目標害蟲對抗蟲植株再次出現(xiàn)抗性，人們開始尋找新的抗性基因。近年來，研究人員在嘗試克隆植物來源的抗蟲轉(zhuǎn)基因代替微生物來源基因，主要涉及的基因有:①蛋白酶抑制劑抗蟲基因，如豇豆胰蛋白抑制劑基因(SCK)和豇豆胰蛋白抑制劑基因(CpTI)等。②植物外源凝集素(Lectin)基因，如雪花蓮凝集素基因(GNA)和半夏凝集素基因(pta)［8］。也有研究者建議轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株混種，以延緩抗蟲群體暴發(fā)的時間。

2.3 抗病 玉米生長期間常受到病毒性病害(矮花葉病、玉米粗縮病等)、真菌性病害(玉米紋枯病)和細菌性病害等侵襲而使其品質(zhì)及產(chǎn)量下降。

向玉米植株抗矮花葉病毒的能力轉(zhuǎn)入能與矮花葉病毒外殼蛋白基因互補的hpRNA后，玉米植株抗矮花葉病毒的能力顯著提高，研究還發(fā)現(xiàn)抗病能力與hpRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的長度相關(guān)［9］。沉默胱抑素基因(CC9)能有效地增強玉米植株對黑粉病的抗性［10］。向玉米中轉(zhuǎn)入一種來至大腸桿菌的核糖核酸內(nèi)切酶基因，玉米植株表現(xiàn)出對玉米粗縮病的抗性［11］。將兔防御素基因(NP-1)導入玉米可有效抗大斑?。?2］。

2.4 抗非生物脅迫 當農(nóng)作物對除草劑、害蟲等獲得抗性成功后，研究者又把關(guān)注點移向非生物脅迫因子，如干旱、鹽堿、缺氮、少磷的環(huán)境。第一個商業(yè)化抗旱轉(zhuǎn)基因玉米品種是孟山都公司研發(fā)的Droughtgard玉米，該品種含有來源于枯草芽孢桿菌的cspB基因，冷休克蛋白cspB能與DNA或RNA結(jié)合，可以促進植物適應(yīng)缺水環(huán)境。LU等［13］向玉米中轉(zhuǎn)入鉬輔因子硫化酶，WANG等［14］向玉米中轉(zhuǎn)入編碼磷脂酰肌醇磷脂酶ZmPLC1基因，AMARA等［15］在玉米中大量表達LEA Rab28蛋白，都增強了玉米對干旱的耐受性。

任小燕等［16］采用超聲波輔助花粉介導法將山菠菜膽堿單加氧酶(AhCMO)基因轉(zhuǎn)入玉米自交系“鄭58”中，結(jié)果表明，CMO的轉(zhuǎn)化提高了玉米的耐鹽性。付光明［17］將玉米表達甜菜堿醛脫氫酶后發(fā)現(xiàn)重組玉米具有較強的耐鹽性。

農(nóng)作物生長發(fā)育需要各種營養(yǎng)元素，但我國部分土壤貧瘠，嚴重影響了糧食生產(chǎn)。針對缺氮、少磷的環(huán)境，大量的試驗正在進行。轉(zhuǎn)鹽芥H+焦磷酸酶(TsVP)玉米在磷酸鹽充足和缺乏的條件下都表現(xiàn)出比對照具有較強活力的根系，在磷酸鹽缺乏條件下，轉(zhuǎn)TsVP玉米生長、產(chǎn)量、繁殖能力都優(yōu)于對照［18］。向玉米導入ZmPTF1基因，可溶性糖在葉片和根部的含量發(fā)生改變，對缺磷的耐受性顯著增強［19］。研究表明miRNA表達可以增強植株對N缺乏發(fā)生生理適應(yīng)［20］。

3 展望

今天，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品已惠及大多數(shù)人，防治乙肝病毒的乙肝疫苗和治療糖尿病的胰島素目前都源自轉(zhuǎn)基因。由于玉米產(chǎn)量大，比單細胞發(fā)酵成本低，比從動物中提取更安全，研究人員開始運用玉米作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)人們急需的糖類、氨基酸、維生素、醫(yī)用蛋白和生物燃料等。目前，我國正通過轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項整合國內(nèi)大部分科研院所的資源，來加快玉米轉(zhuǎn)基因研究步伐，這對于解決我們面臨的環(huán)境惡化、資源匱乏、糧食短缺等問題具有重要作用。

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