王 茜，龍驪豐，韋鵬霄，岑秀芬，萬正林，3，龍明華*

(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧530004;2.廣西大學(xué)行健文理學(xué)院理工學(xué)部，廣西南寧530005;3.廣西現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園，廣西南寧530007)

野韭菜(Allium hookeri Thwaites)為百合科蔥屬多年生草本植物，原稱為寬葉韭，又稱為大葉韭、觀音菜、巖蔥等，我國各地均有分布［1］。野韭菜和普通韭菜很相似，多以其嫩葉和成長葉食用。其葉片較寬，纖維含量稍多，具有蔥香味，富含碳水化合物、維生素C及硫、鐵、磷等礦物質(zhì)元素，尤其含豐富的胡蘿卜素和纖維素，還含有辛香的揮發(fā)性物質(zhì)——硫化丙烯，有增進(jìn)食欲和殺菌的作用［2］。此外，野韭菜還有溫中行氣、散血解毒、健胃整腸等功效［1］。由于野韭菜的保健功能和人們崇尚回歸自然的消費理念，目前市場上對包括野韭菜在內(nèi)的野生蔬菜的需求與日俱增，供不應(yīng)求。但野韭菜只開花而不能結(jié)籽，其繁殖方式以分株繁殖為主，繁殖周期長，繁殖率低，極大影響了野韭菜的大面積推廣種植，因此研究野韭菜的組培快繁技術(shù)顯得尤為重要。目前有關(guān)野韭菜的組織培養(yǎng)方面的研究較少，筆者研究了影響野韭菜花器官脫分化的誘導(dǎo)因子，旨在為建立野韭菜組織培養(yǎng)快繁體系奠定技術(shù)基礎(chǔ)，也為野韭菜種質(zhì)資源的保存和開發(fā)利用探索生物技術(shù)上的方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 以采自廣西金秀縣圣堂山上的野韭菜花器官(花莖、花盤、花柄、花蕾)為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制。以 MS、Miller、White培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加不同的植物生長調(diào)節(jié)劑，附加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L，pH 調(diào)至5.8。

1.2.2 外植體滅菌。于晴天上午采取健壯且無病蟲害的花器官。按照花苞開放狀態(tài)(未開、半開、全開)，將花器官材料分為3組。分別將3組材料置于洗潔精溶液中，用軟毛刷輕刷表面塵埃后用清水沖洗30 min;在超凈工作臺上將洗凈的材料置于無菌燒杯中，用75%乙醇精漂洗30 s;再用0.1%升汞浸泡滅菌10 min，并不斷晃動;滅菌完畢用無菌水清洗5次，備用。

1.2.3 外植體接種。將滅過菌的花蕾、花柄、花盤、距花盤5 cm內(nèi)的花莖等外植體分別接入添加不同激素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。每組處理接30瓶，每瓶接種3個外植體，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4 培養(yǎng)條件。將接種好的試驗材料置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，暗培養(yǎng)15 d后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx，光照時間12 h/d。

1.3 數(shù)據(jù)分析 接種后定期觀察各種外植體、各試驗處理的愈傷組織發(fā)生情況，觀察愈傷組織的質(zhì)量、出愈時間并統(tǒng)計岀愈率。運用電子表格軟件(Excel2003)、方差分析軟件(SPSS18.0)對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基種類對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由于不同基本培養(yǎng)基所含的礦物質(zhì)種類和配比差異較大，因此對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的效果也存在差異。從表1可以看出，在MS、Miller、White 3種基本培養(yǎng)基中加入相同的激素組合，MS培養(yǎng)基對花苞未開花蕾的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，愈傷組織的質(zhì)量也最好。這可能是由于MS基本培養(yǎng)基的礦物質(zhì)種類及比例較適合野韭菜花蕾愈傷組織的發(fā)生?；ɡ俚挠鷤M織誘導(dǎo)率由高到低的基本培養(yǎng)基順序為MS＞Miller＞W(wǎng)hite。各個處理的差異均達(dá)極顯著水平。這表明選擇合適的基本培養(yǎng)基可以提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，MS基本培養(yǎng)基最適合野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織的誘導(dǎo)。

表1 培養(yǎng)基種類對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不同種類生長素與6-BA組合對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的影響 生長素是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的物質(zhì)之一，不同生長素對植物愈傷組織的形成影響不同。從表2可以看出，在相同濃度的NAA、IAA、IBA、2，4-D與同一濃度的6-BA組合處理中，以NAA與6-BA組合的處理對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導(dǎo)率最高，其次是2，4-D，再次是IBA，最低是IAA，4種生長素處理之間的差異達(dá)極顯著水平。這表明選擇合適的生長素可以提高花苞未開花蕾愈傷組織的誘導(dǎo)率，在4種生長素中NAA最適合野韭菜花苞未開花蕾愈組的誘導(dǎo)。

表2 不同種類生長素與6-BA組合對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 不同濃度NAA與6-BA組合對野韭菜不同發(fā)育時期花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的影響 不同濃度的NAA與6-BA組合對野韭菜不同發(fā)育時期花蕾愈傷組織的誘導(dǎo)影響不同。從表3可以看出，在相同的花苞開放狀態(tài)下，當(dāng)NAA的濃度在0～1.5 mg/L時，對野韭菜花蕾的愈傷組織誘導(dǎo)率呈低高低的趨勢。其中濃度在1.0 mg/L時最高。各處理之間差異達(dá)極顯著水平。在相同的培養(yǎng)基及激素處理中，花苞不同開放狀態(tài)下的花蕾岀愈率由高到低為未開狀態(tài)＞半開狀態(tài)＞全開狀態(tài)。這表明1.0 mg/L 6-BA與1.0 mg/L NAA組合較適合野韭菜花蕾愈傷組織的誘導(dǎo)，而選擇花苞未開的花蕾作為外植體可以提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。

表3 不同濃度NAA與6-BA組合對野韭菜不同發(fā)育時期花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 不同激素組合對野韭菜花苞未開花器官不同部位愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以MS+6-BA1.0 mg/L+NAA1.0 mg/L培養(yǎng)基為對照并分別添加0.5 mg/L 2，4-D、KT和CPPU對花苞未開放狀態(tài)下的花器官不同部位的愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行對比。結(jié)果表明，同一激素組合對花蕾、花柄、花盤和花莖的愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。按愈傷組織誘導(dǎo)率高低排序為花盤＞花蕾＞花柄＞花莖;按激素誘導(dǎo)愈傷組織的生理功效排序為2，4-D＞CPPU＞KT。3種激素處理愈傷組織誘導(dǎo)率的差異均達(dá)到極顯著水平。這表明花器官不同部位的愈傷組織誘導(dǎo)效果存在明顯的部位效應(yīng)，花盤的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%，其次是花蕾，最差的是花柄，而花莖無愈傷組織發(fā)生。

表4 不同激素組合對野韭菜花苞未開花器官不同部位愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3 討論

3.1 基本培養(yǎng)基的影響 器官發(fā)生是生物學(xué)中的基本問題之一，受到各種內(nèi)外因子的影響及調(diào)控。培養(yǎng)基能為植物的生長提供營養(yǎng)，是組織培養(yǎng)過程中必不可少的物質(zhì)基礎(chǔ)。不同植物的遺傳特性、生物學(xué)特性、生態(tài)學(xué)特性不同，這使得植物對各種營養(yǎng)元素的吸收量不同，最適培養(yǎng)基的成分也存在差異。饒月輝等［4］通過試驗比較了 MS、WH、LS、N6和 SH 5種培養(yǎng)基對韭菜栽培品種莖尖培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明，MS是韭菜栽培品種莖尖組織培養(yǎng)最適基本培養(yǎng)基。李勇等［5］、王明耀等［6］、王桂英［7］分別通過花托、花器官、根尖在 MS培養(yǎng)基上添加不同的激素成功地誘導(dǎo)出韭菜栽培品種的愈傷組織，只是未做不同培養(yǎng)基的對比試驗。結(jié)果表明，在MS、Miller、White 3種培養(yǎng)基中，MS培養(yǎng)基對野韭菜花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的效果最好。原因可能是MS培養(yǎng)基屬于富集元素平衡培養(yǎng)基，大量元素和微量元素的含量齊全且豐富，具有較好的誘導(dǎo)性能;而Miller和White分別是中等無機(jī)鹽培養(yǎng)基和低無機(jī)鹽培養(yǎng)基［8－9］，它們的組成或含量并未達(dá)到誘導(dǎo)野韭菜花蕾出愈的最佳要求。

3.2 植物生長調(diào)節(jié)劑的影響 在組織培養(yǎng)過程中添加一定種類和濃度的生長調(diào)節(jié)劑是植物脫分化和再分化的重要手段［10］。植物生長內(nèi)源調(diào)節(jié)物質(zhì)對植物組織和細(xì)胞的增殖、分化起著關(guān)鍵作用;培養(yǎng)基中的外源植物調(diào)節(jié)劑主要是通過對細(xì)胞的基因表達(dá)與活性調(diào)控影響細(xì)胞的脫分化，其適宜的種類和配比水平，反映了植物組織和器官的內(nèi)源激素水平的差異與其在脫分化過程中對這些物質(zhì)的要求［11－12］。植物生長調(diào)節(jié)劑在一定的范圍內(nèi)能促進(jìn)生長，但過高或過低都會影響其生長［13］。該試驗結(jié)果表明，在 NAA 0～1.5 mg/L時，當(dāng)濃度為1.0 mg/L時愈組誘導(dǎo)率最高，為NAA的最佳濃度。王明耀等［6］通過試驗證明花器官的岀愈率主要與生長素和細(xì)胞分裂素的種類和配比有關(guān)，在其處理中添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L 2組激素組合的 MS培養(yǎng)基對韭菜栽培品種花蕾愈傷組織誘導(dǎo)效果明顯，與該研究較一致。該研究進(jìn)一步進(jìn)行了生長素種類及濃度的篩選試驗，使試驗進(jìn)一步細(xì)化，發(fā)現(xiàn)在愈傷組織誘導(dǎo)階段，2，4-D的效果優(yōu)于CPPU，更優(yōu)于KT。

3.3 植物生理狀態(tài)的影響 已分化的植物細(xì)胞具有全能性。一般而言，細(xì)胞全能性的高低與細(xì)胞的分化程度有關(guān)，分化程度越高，細(xì)胞全能性越低，全能性的表達(dá)就越困難。對于野韭菜而言，花器官是其生長發(fā)育最旺盛的部位之一。在形態(tài)發(fā)生的研究中，將外源激素與物種的遺傳性及器官和組織的生理狀態(tài)聯(lián)系起來的工作很有限，且外源激素對器官發(fā)生的作用機(jī)理也不十分清楚［14］。因此建立一個較好的試驗材料體系是必須且重要的。

該研究證明野韭菜花苞開放狀態(tài)是影響花器官岀愈率的主要影響因子。花苞未開花器官是培養(yǎng)野韭菜植株再生的優(yōu)良外植體，其中花盤岀愈率最高，為100%。花莖在所研究的花苞各種開放狀態(tài)下及各種激素組合下無分化能力，不推薦其作為野韭菜快繁的外植體材料。說明植物的遺傳性及生理狀態(tài)在形態(tài)發(fā)生過程中所起的作用可能比激素本身更加關(guān)鍵。此結(jié)論與王明耀［6］、郝建平等［15］的試驗結(jié)果一致。因此，通過脫分化途徑來進(jìn)行野韭菜組培快繁時，應(yīng)注意在外植體材料本身的遺傳性及生理狀態(tài)方面進(jìn)行篩選。

4 結(jié)論

綜上所述，MS培養(yǎng)基最適合野韭菜花蕾愈傷組織誘導(dǎo);2種激素組合中以6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L對花苞未開花蕾愈組誘導(dǎo)效果最好;3種激素組合中以2，4-D、6-BA與NAA的組合對野韭菜花器官愈傷組織誘導(dǎo)效果最好;岀愈率高低按照花器官部位排序為花盤＞花蕾＞花柄＞花莖;岀愈率高低按照花器官發(fā)育時期即花苞開放狀態(tài)排序為未開狀態(tài)＞半開狀態(tài)＞全開狀態(tài)。

對野韭菜花器官脫分化得到的愈傷組織進(jìn)行繼代增殖，再分化獲取完整植株等后續(xù)試驗研究正在進(jìn)行之中。

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