張成玲， 趙永強， 楊冬靜， 孫厚俊， 徐 振， 謝逸萍

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 徐州221131)

蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)屬于馬鈴薯Y 病毒屬(Potyvirus)成員，其寄主范圍廣，可侵染43 科156 屬的300 多種植物［1-3］，是蔬菜上僅次于黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)的第2 大病毒［4-5］，對蘿卜、白菜、花椰菜等十字花科蔬菜危害嚴重，造成巨大經(jīng)濟損失。

從1941 年凌立和楊演首先報道四川油菜花葉病是由TuMV 引起以來，許多學者開展了一系列檢測、鑒定、分子變異等研究［6-8］。近10 年來，有關(guān)TuMV 病毒的分子變異與進化等研究有了突飛猛進的發(fā)展，尤其是對TuMV 分離物的寄主致病性和序列重組的研究［8-10］。Ohshima 等［11］用生物學與分子生物學相結(jié)合的方法將來自不同地域的76個TuMV 分離物劃分為2 個致病型:B 型(只侵染Brassica)和BR 型(既侵染Brassica，又侵染Raphanus)。根據(jù)cp等基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析，將76 個分 離 物 分 成 了Basal-B、Basal-BR、Asian-BR 和World-B 組，Basal-BR 組中沒有中國分離物。Tian等［12］將中國的TuMV 分離物分為3 個組:Asian-BR、World-B 和Basal-BR 組，其中Basal-BR 組分離物出現(xiàn)在2004 年，是中國有關(guān)TuMV Basal-BR 組的首次報道。除了對類群劃分外，對基因組的重組研究發(fā)現(xiàn)，TuMV 重組普遍存在，多集中在P1 和NIa-VPg 之間［9，13］。本研究將利用分子生物學手段對3 個不同寄主植物上的TuMV 分離物進行類群劃分，確定它們的歸屬地位，為抗病育種工作提供分子生物學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

3 個TuMV 分離物XZLB、XZYC、XZBOC 分別采自江蘇徐州表現(xiàn)花葉癥狀的蘿卜、上海青油菜和菠菜上，經(jīng)莧色藜3 次單斑分離獲得，并保存于普通煙草(Nicotiana tabacumL.)上。

大腸桿菌為DH5α、DNA 分子量標準DL2000、RNA 提取試劑盒均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，pMD18-T 載體、反轉(zhuǎn)錄酶(MLV)購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR 所用Taq酶購自美國Invitrogen 公司。其他生化試劑及普通化學試劑均為進口或國產(chǎn)生化級或分析純級試劑。

1.2 TuMV cp 基因的RT-PCR 擴增

根據(jù)GenBank 中報道的TuMV 的cp基因序列，參考宋云枝［1］等文獻合成特異引物:上游引物TuMV-CPF:5'-CAGGTGAAACGCTTGACGCA-3';下游引物TuMV-CPR:5'-TCATAACCCCTGAACGCCAAG-3'，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用RNA 提取試劑盒提取植物樣品總RNA。以總RNA 為模板，MLV酶進行反轉(zhuǎn)錄，RT-PCR 擴增cp基因的cDNA。PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，70 ℃延伸1 min，30 個循環(huán);70 ℃延伸10 min。

1.3 TuMV 擴增產(chǎn)物序列測定

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳分離目的片段，并連接到pMD18-T 載體中，提取質(zhì)粒并進行PCR 鑒定［14］，鑒定為陽性的克隆送交生工生物工程(上海)股份有限公司進行核苷酸序列測定，每個分離物選取3 個重組子進行序列測定，比較后，確定其核苷酸序列。

1.4 TuMV cp 基因的核苷酸序列系統(tǒng)進化分析

利用Clustal X1.81 軟件，將3 個分離物的cp基因序列與GenBank 中的36 個分離物cp基因序列進行序列比對，利用RDP 4 軟件包軟件進行重組分析，DnaSP5進行基因交流等分析［15-16］。利 用MEGA5.0 等軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)樹。本研究所用分離物包含在 Asian-BR、Basal-B、Basal-BR、World-B 4 個組內(nèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TuMV 江蘇分離物cp 基因的RT-PCR 及序列分析

經(jīng)RT-PCR 擴增后電泳的結(jié)果顯示，在分子量為850 bp 左右處呈現(xiàn)電泳條帶，沒有其他非特異性DNA 條帶，其大小與已報道的TuMVcp基因分子量相似，說明此條帶即為TuMV 江蘇分離物cp基因的擴增產(chǎn)物。經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒鑒定后，送陽性克隆測序，3 個分離物cp大小均為867 bp。經(jīng)DNAMAN 比對，3 個不同寄主植物上的TuMV 分離物之間cp基因的核苷酸序列的一致率較高，XZYC 與XZLB 和XZBOC 的一致率均為99.9%，XZLB 與XZBOC 一致率為99.8%，氨基酸一致率均為100.0%。3 個分離物分別與GenBank中36 個分離物的序列進行比對，結(jié)果表明，3 個分離物與GU167976 等分離物一致率最高，為99.0%。

2.2 TuMV cp 基因的核苷酸重組和基因流分析

將本研究的3 個分離物與GenBank 中36 個分離物進行重組分析，結(jié)果表明，只有KGD851J、CHZJ26 兩個分離物LARD 軟件支持其重組，其余軟件都不支持，因此，所分析的所有分離物在cp基因上無明顯重組。通常利用Ks*、Z和Snn值的P值判定基因之間的遺傳分化顯著性。假設(shè)i和l代表2 個地區(qū)，j和k分別為這2 個地區(qū)的序列，那么dij，lk代表i地區(qū)的第j條序列和l地區(qū)的第k條序列之間的差異(限制性位點或核苷酸位點)數(shù)量。Ks*是衡量i地區(qū)內(nèi)的序列差異數(shù)量的平均值Ki，i=1，2;Z是“rank statistics”，是Zi的加權(quán)和，Zi是i地區(qū)內(nèi)的序列對dij，lk和的平均值;Snn，為近鄰統(tǒng)計，是在相同的地理學空間上近鄰序列出現(xiàn)的頻率。表1 顯示江蘇分離物和山東分離物之間遺傳分化顯著，而兩個組內(nèi)的遺傳分化不顯著。Nm是研究群體是否發(fā)生遺傳漂變的主要參數(shù)，當Nm＜1 時，群體之間很容易發(fā)生遺傳漂變，因此遺傳漂變是促使江蘇和山東分離物之間發(fā)生遺傳分化的主要原因。FST是測定分離物之間的基因流，若FST絕對值均小于0.330 00，說明兩地區(qū)之間基因交流頻繁;反之，則不頻繁。基因流結(jié)果表明，山東分離物之間、江蘇分離物之間、山東和江蘇分離物之間的FST絕對值均小于0.330 00，說明兩地區(qū)之間基因交流頻繁(表1)。

2.3 cp 基因的核苷酸序列系統(tǒng)進化分析

圖1 顯示，蕪菁花葉病毒的分離物分為4 個組，分別為Basal-BR、World-B、Asian-BR、Basal-B;Basal-BR 組又分為了2 個亞組，日本的2 個分離物聚為一簇為日本亞組，中國的Basal-BR 分離物聚為一簇，為中國亞組;本研究所得的3 個分離物與Taigu、HZLB2 兩個分離物單獨聚為一簇。

表1 TuMV 江蘇和山東分離物遺傳分化和基因流Table 1 Genetic differentiation and gene flow of isolates from Jiangsu and Shandong province

3 討論

本研究通過RT-PCR 獲得了不同寄主植物上的3 個TuMV 分離物，通過分子生物學方法分析了中國和日本的部分TuMVcp基因序列。結(jié)果表明，3 個分離物一致率較高，在99.8% 以上。構(gòu)建系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，日本Basal-BR 組的2個分離物單獨成一個亞組(日本亞組)，而中國Basal-BR 組分離物為中國亞組，本研究的3 個分離物均位于Basal-BR 組，且聚為一簇，無明顯寄主特異性。自Tian 等［12］發(fā)現(xiàn)中國存在Basal-BR組分離物以來，中國Basal-BR 組分離物數(shù)量迅速增多。

遺傳重組是馬鈴薯Y 病毒屬病毒變異的一個重要因素，TuMV 含有多個重組熱點，多數(shù)重組發(fā)生在P1基因和CI/6K2/VPg基因區(qū)域［13］，只有極少數(shù)重組發(fā)生在CP 和3'-UTR 區(qū)域［7，10，12］。本研究所分析的cp基因無明顯重組，TuMV 不同分離物cp基因之間存在著地域差異，江蘇和山東分離物之間基因交流頻繁，可能與地區(qū)之間引種頻繁有關(guān);但兩地區(qū)之間遺傳分化顯著，可能是中國地域廣闊，環(huán)境差異明顯，病毒需適應(yīng)新的環(huán)境造成。江蘇分離物寄主為白菜、蘿卜和菠菜等，但這些寄主分離物間遺傳差異不顯著。

研究病毒的遺傳變異，有助于我們了解寄主植物、環(huán)境和對病毒變異的影響，通過這些遺傳變異信息便于我們設(shè)計病毒防治策略［16-18］。隨著對TuMV 分子遺傳結(jié)構(gòu)和種群變異研究的深入，我們能更好地了解不同國家、地區(qū)及不同寄主間TuMV種群特點，標記不同的TuMV 抗性基因［19-21］，或針對某一類群(如中國TuMV Basal-BR 分離物發(fā)生普遍、擴展迅速)培育抗性持久的抗TuMV Basal-BR 種群的蔬菜品種或利用交叉保護來有效控制TuMV 的發(fā)生。

圖1 基于蕪菁花葉病毒部分分離物的cp 基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic trees constructed using the neighbour-joining based on cp gene nucleotide sequences of turnip mosaic virus isolates

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