彭勝，王志宏，鄭陽，史麗娟，趙帥，唐坤海，彭密軍

(吉首大學(xué) 林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室 杜仲湖南省工程實驗室，湖南 張家界 427000)

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)為我國特有名貴滋補中藥材，其皮入藥已有兩千多年歷史，早在漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》中就被列為“上品”，具有“三降六抗一增”等作用［1］?？寡趸煞秩琰S酮、多酚類化合物是杜仲的主要活性物質(zhì)，它們通過清除體內(nèi)自由基、還原氧化物質(zhì)，達到延緩衰老、提高機體免疫力等效果［2-4］。目前杜仲皮提取物各萃取部位的抗氧化活性尚無報道。本實驗對杜仲皮不同萃取部位的體外清除·OH 和·DPPH 活性進行研究，以期為杜仲皮的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

杜仲皮2012 年5 月于吉首大學(xué)張家界校區(qū)后山采摘(經(jīng)廖博儒研究員鑒定為杜仲)，50 ℃烘干，粉碎并過40 目篩，備用;1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基(·DPPH);無水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、鹽酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰二氮菲等均為分析純;所有用水為超純水。

U-3900 紫外可見分光光度計;KQ-250E 超聲波清洗器;Hei-VAP 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;BM400 數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋;AEG-220 電子天平。

1.2 實驗方法

1.2. 1 杜仲皮不同萃取物的制備準確稱取1 000 g杜仲樣品以料液比1∶15 加入60%乙醇水溶液超聲輔助提取40 min，濾渣以1∶10 料液比重復(fù)提取1 次，合并濾液并濃縮至1 000 mL，依次用1 000 mL石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取相和萃余相分別于55 ℃濃縮成浸膏，冷凍干燥得石油醚萃取物0. 947 8 g，三氯甲烷萃取物2.978 5 g，乙酸乙酯萃取物6.909 0 g，正丁醇萃取物15.232 0 g，萃余相物質(zhì)100.737 0 g。

1.2.2 杜仲皮不同萃取物清除·OH 活性測定采用鄰二氮菲-Fe2+-H2O2法［5］，按表1 數(shù)據(jù)分別加入試劑后，定容至10 mL，混合均勻，于37 ℃水浴中反應(yīng)1 h，紫外可見分光光度計上510 nm 處測定吸光值(3 個平行)，計算杜仲皮不同萃取物對·OH的清除率，見下式。

式中 A0——空白參比吸光值;

A1——未損傷管吸光值;

A2——損傷管吸光值;

A3——樣品參比吸光值;

A4——樣品管吸光值。

表1 鄰二氮菲-Fe2+-H2O2 反應(yīng)體系加樣表Table 1 Protocol of phenanthroline-Fe2+-H2O2 reaction system mL

1.2.3 杜仲萃取物清除·DPPH 活性測定［5］精密稱取1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基，用無水乙醇溶解并配制成0.20 mmol/L 溶液。按表2 分別加入試劑和樣品后，25 ℃水浴中保溫30 min，以無水乙醇為對照，在紫外可見分光光度計上514 nm 測定吸光值，計算杜仲皮不同萃取物對·DPPH 的清除率，見下式。

表2 清除·DPPH 加樣表Table 2 Protocol of scavenging·DPPH

2 結(jié)果與討論

2.1 杜仲萃取物清除·OH 活性測定

自由基是體內(nèi)進行物質(zhì)代謝時產(chǎn)生的，高化學(xué)活性的自由基氧化不飽和脂肪酸，導(dǎo)致細胞功能突變或衰退，從而引起老化和一系列病變及多種疾病。杜仲皮中含有豐富的抗氧化物質(zhì)，這些物質(zhì)通過清除機體內(nèi)自由基，還原氧化物質(zhì)，從而達到保護機體，延緩衰老的作用。

圖1 杜仲皮不同萃取物清除·OH 活性Fig.1 Scavenging activity of different solvent fractions from the bark of Eucommia ulmoides Oliv. on·OH

圖2 Vc 清除·OH 活性Fig.2 Scavenging activity of Vc on·OH

由圖1、圖2 可知，在0.5 ～300 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，杜仲不同萃取物隨著質(zhì)量濃度的增加，對·OH的清除率先升高后降低。萃取物中清除活性最高的是正丁醇相，當其質(zhì)量濃度為190 μg/mL 時清除率達到75.23%，與抗壞血酸最大清除率很接近;乙酸乙酯相清除作用次之，當質(zhì)量濃度為230 μg/mL時，清除率為68.84%;氯仿相清除率稍低，清除率為50.01%;石油醚相和萃余相清除率最低，均低于20%?？赡苁怯捎诓煌瑯O性溶劑萃取物的活性成分不同，其清除·OH 的能力不同。

2.2 杜仲皮不同萃取物清除·DPPH 活性測定

在細胞進行代謝的過程中，自由基作為副產(chǎn)物源源不斷的產(chǎn)生，少量自由基對人體有益，過量則會破壞細胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞功能喪失，造成機體損害。·DPPH 是一種有機自由基，可用其測定抗氧化物質(zhì)打斷脂質(zhì)氧化或蛋白質(zhì)氧化的鏈鎖反應(yīng)的能力?？寡趸镔|(zhì)清除·DPPH 反應(yīng)原理為·DPPH 溶于乙醇等有機溶劑中且呈紫色，性質(zhì)穩(wěn)定，抗氧化劑的供氫離能力使得·DPPH 的孤對電子被配對而使其褪色，514 nm 處測得的特征吸收峰吸光值變小［6］。

由圖3、圖4 可知，杜仲皮不同萃取物質(zhì)量濃度和清除· DPPH 活性存在量效關(guān)系。在0 ～120 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，·DPPH 清除率隨著萃取物質(zhì)量濃度的增大而增大，當質(zhì)量濃度為120 μg/mL時，清除·DPPH 效果依次為乙酸乙酯相＞正丁醇相＞氯仿相＞萃余相＞石油醚相，最大清除率高達93.01%，可能原因在于以上萃取溶劑對于多酚類化合物等抗氧化成分萃取能力依次降低。

圖3 杜仲皮不同萃取物清除·DPPH 活性Fig.3 Scavenging activity of different solvent fractions from the bark of Eucommia ulmoides Oliv. on·DPPH

圖4 Vc 清除·DPPH 活性Fig.4 Scavenging activity of Vc on·DPPH

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，杜仲皮不同萃取物對·OH和·DPPH 均有一定的清除能力。其中乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相清除自由基效果較佳，可以用來開發(fā)抗氧化劑。

［1］ 杜紅巖.杜仲優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培［M］.北京:中國林業(yè)出版社，1996.

［2］ 黃美娥，曠勇，彭勝，等. 杜仲粉絲中活性成分同時提取條件及其含量測定研究［J］. 食品科技，2012，37(7):206-208.

［3］ 葉文峰.杜仲葉中化學(xué)成分、藥理活性及應(yīng)用研究進展［J］.林產(chǎn)化工通報，2004，38(5):40-44.

［4］ 晏媛，郭丹. 杜仲葉的化學(xué)成分及藥理活性研究進展［J］.中成藥，2003，25(6):491-492.

［5］ 彭密軍，彭勝，吳吉林，等. 杜仲素抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2010，31(19):84-86.

［6］ 彭勝.杜仲葉抗氧化活性成分研究及桃葉珊瑚甙的制備［D］.吉首:吉首大學(xué)，2011.