劉立峰

（洞口縣第二中學(xué)，湖南 洞口 422302）

1 目的和意義

1.1 邵陽(yáng)市洞口縣山區(qū)的雪峰山地區(qū)生長(zhǎng)著一種野生經(jīng)濟(jì)植物——蕨(Pteridium aquilinum var.latiusculum)，屬蕨類，鳳尾蕨科，多年生草本。當(dāng)?shù)厝朔Q“蕨菜”，因富含營(yíng)養(yǎng)，幼葉可食，并可用做中草藥治療疾病，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是洞口縣山區(qū)野生植物多樣性不可缺少的一部分。

1.2 隨著環(huán)境對(duì)栽培蔬菜的污染與“綠色食品”的興起，使野生蔬菜受到邵陽(yáng)市們普遍青睞。蕨也不例外，蕨菜制品成了人們餐桌上的佳肴。山區(qū)人們由于經(jīng)濟(jì)的需求，無(wú)計(jì)劃地大量采摘野生蕨出售，多年來(lái)對(duì)這種野生植物的人為破壞越來(lái)越嚴(yán)重。據(jù)調(diào)查，洞口縣野生蕨的蘊(yùn)藏量大約有6.4 萬(wàn)公斤，但現(xiàn)在許多地區(qū)野生蕨已很少見(jiàn)，洞口縣蕨菜收購(gòu)量大幅下降也證明了資源的日趨減少，盲目地采摘與收購(gòu)對(duì)自然資源的破壞令人擔(dān)憂。

1.3 蕨類植物的繁殖主要依靠營(yíng)養(yǎng)繁殖與孢子繁殖。洞口縣的野生蕨由于受到氣候的影響，孢子繁殖困難，通常利用地下莖進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，繁殖率低。人們食用的蕨菜是野生蕨的幼苗，采摘幼苗又破壞了地下莖，使得野生蕨的繁殖更加困難。有人提出警告：洞口縣部分地區(qū)野生蕨已有滅絕的危險(xiǎn)。面臨這種現(xiàn)狀，我們開(kāi)展了，一些試驗(yàn)研究，試圖通過(guò)組織培養(yǎng)和微繁殖保護(hù)，以提高它的繁殖能力，增加物種的豐富度，達(dá)到保護(hù)和合理利用的目的，同時(shí)也利于洞口縣山區(qū)生物多樣性的持續(xù)發(fā)展。

2 組織培養(yǎng)和微繁殖

2.1 材料的來(lái)源

2013 年11 月采自邵陽(yáng)市洞口縣府君山家植試驗(yàn)田。此時(shí)植株正值休眠期，將未萌動(dòng)的地下莖移栽至花盆內(nèi)，移入溫室，使部分地下莖提前萌動(dòng)。

2.2 外植體的滅菌方法

外植體先用少量洗衣粉做清潔處理，然后水流沖洗30 分鐘，用濾紙將外植體表面水分吸凈后再用HgCl2滅菌10 分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗5 遍。

2.3 第一階段的工作，由2013 年12 月18 日開(kāi)始

（1）制備3 種類型的培養(yǎng)基，MS 培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基

1#MS+2.4D-2mg／L+NAA0.5mg／L

2#MS+2.4D-0.5mg／L+NAA0.1mg／L

3#MS+6BA2mg／L+NAA0.2mg／L+CH100mg／L

上述培養(yǎng)基中均加3%的蔗糖、0.8%的瓊脂，pH 值為5.8。

（2）接種和培養(yǎng)

外植體取休眠期帶頂芽的地下莖(長(zhǎng)約3cm)，用外植體的滅菌方法滅菌后，在無(wú)菌條件下切成0.3～0.5cm 的帶有頂芽的莖段和不帶有頂芽的莖段，并分別接種在3 種不同的培養(yǎng)基上，置于25℃～28℃暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

（3）生長(zhǎng)與分化

10 天后觀察兩種不同位置的莖段在3 種不同培養(yǎng)基上的發(fā)育狀況(表1)。

將培養(yǎng)基上頂芽膨大且?guī)в杏鷤M織的莖段，轉(zhuǎn)移到新鮮的2#培養(yǎng)基上，分別置于光照條件和非光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)，第20、40、60天時(shí)觀察其生長(zhǎng)情況(表2)。

2.4 第二階段的工作，由2014 年1 月7 日開(kāi)始

（1）制備2 種不同的培養(yǎng)基(仍以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基)

16#MS+6BAlmg／L+IBAlmg／L+活性炭1.5g／L

7#MS+6BA0.5mg／L+NAA0.1mg／L

上述培養(yǎng)基均加入2%的蔗糖、0.8%的瓊脂，pH 值為5.8。

（2）接種與培養(yǎng)

外植體取在破休眠期已經(jīng)萌發(fā)出地面的綠色幼嫩根狀莖(無(wú)菌方法同上無(wú)菌條件下切成0.8～1cm 的帶頂芽和不帶頂芽的莖段，分別接種在2 種不同的培養(yǎng)基上，置于25℃-28℃光照條件下培養(yǎng)。

（3）生長(zhǎng)與分化(表3)

表3 生長(zhǎng)與分化

2.5 第三階段的工作，微繁殖試驗(yàn)，由2014 年2 月20 日開(kāi)始

（1）制備2 種不同培養(yǎng)基(仍以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基)。

16#(同上)

17#MS+KTlmg／L+蔗糖2%+瓊脂0.8%pH 值5.8

（2）取在16#培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成的幼苗(不需再滅菌)，分別切成頂芽基部莖段(包括節(jié)間)、幼葉，分別接種在2 種不同培養(yǎng)基上，置于25℃～28℃光照條件下培養(yǎng)。

（3）生長(zhǎng)與分化。30 天后觀察，不同類型的外植體在16#培養(yǎng)基上變化不大，但都能保持綠色。在17#培養(yǎng)基上，莖段(包括節(jié)間)、幼葉也變化不大，只有已切去幼葉的頂芽基部形成了具有6～8 個(gè)小芽的綠色叢生芽。將叢生芽分割轉(zhuǎn)至新的17#培養(yǎng)基上，又可形成新的叢生芽。2 周后叢生芽伸長(zhǎng)，形成幼苗，繼續(xù)培養(yǎng)4 周后可分化出白色的不定根，形成一株完整的試管苗，試管苗可在試管內(nèi)培養(yǎng)2 個(gè)月而不更換培養(yǎng)基。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看出，休眠芽不能作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，無(wú)論在何種條件下，很難誘導(dǎo)分化成苗。打破休眠的帶頂芽的幼莖是最好的外植體，16#、17#培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)最有效的培養(yǎng)基。綜合以上實(shí)驗(yàn)，我們可以總結(jié)一套野生蕨組織培養(yǎng)的最佳方案，形成完整的試管苗。

3.2 野生蕨可以在離體條件下形成幼苗，在200mL 的三角瓶?jī)?nèi)的完整試管苗生長(zhǎng)2～3 個(gè)月不更換培養(yǎng)基，用這種微繁殖的方法，為野生蕨建立一種獨(dú)立的保護(hù)系統(tǒng)。對(duì)其他瀕臨滅絕的植物也可以采用微繁殖的方法，建立保護(hù)系統(tǒng)。

4 收獲和體會(huì)

4.1 野生蕨的組織培養(yǎng)，能夠快速繁殖大量的蕨的試管苗，對(duì)保護(hù)野生資源，推廣人工栽植蕨菜的生產(chǎn)有一定的意義。

4.2 通過(guò)參加生物實(shí)驗(yàn)小組的活動(dòng)，我學(xué)會(huì)了科學(xué)研究的工作方法，激發(fā)了我對(duì)生命科學(xué)的研究興趣，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到生物多樣性是21 世紀(jì)人類最關(guān)心的問(wèn)題。