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都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100020

國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100021

都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科腫瘤，北京100006

MTA1是1993年P(guān)encil等利用差異cDNA文庫(kù)篩選技術(shù)，從具有轉(zhuǎn)移潛能的大鼠乳腺癌細(xì)胞株13762NF中篩選分離出的一個(gè)乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[1]。隨后大量研究表明MTA1普遍高表達(dá)于乳腺癌、肺癌、腸癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、胸腺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌等大多數(shù)類(lèi)型的人類(lèi)腫瘤組織中，參與了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞增殖、放化療耐受等眾多惡性行為的調(diào)控過(guò)程[2]。

MTA1/NuRD復(fù)合體是目前發(fā)現(xiàn)的MTA1參與腫瘤調(diào)控的一個(gè)最主要機(jī)制。NuRD即核小體重塑及組蛋白去乙酰化復(fù)合體，它由HDAC1、HDAC2、RbAp46、RbAp48、MTA1、MBD3 及 Mi2七種蛋白組成[3]。通過(guò)NuRD復(fù)合體MTA1在細(xì)胞核內(nèi)抑制了多種腫瘤抑癌基因的表達(dá)，如BRCA1[4]、p21 WAF1[5]、HIC1[6]等。但最近研究表明MTA1不僅定位于胞核，在胞質(zhì)中也有明顯的分布，我們課題組的大量研究數(shù)據(jù)也充分證明了這一點(diǎn)。對(duì)于胞質(zhì)定位的MTA1是否也存在于NuRD復(fù)合體中并通過(guò)其發(fā)揮功能這一疑問(wèn)，至今還未見(jiàn)報(bào)道。

In Situ PLA技術(shù)是瑞典的Olink Bioscience公司發(fā)明的一項(xiàng)可以用于原位定量檢測(cè)蛋白相互作用的新技術(shù)。鄰位連接技術(shù)（proximity ligation assay，PLA）的原理是使用一對(duì)標(biāo)記有一段寡聚脫氧核苷酸（單鏈DNA）的二抗探針（PLA探針）分別識(shí)別兩種已經(jīng)結(jié)合了不同目的蛋白的一抗，如果這兩種目的蛋白具有相互作用，那么此時(shí)兩個(gè)PLA探針之間的距離就會(huì)非常接近（＜40 nm），即產(chǎn)生了所謂的鄰近效應(yīng)（proximity）。此時(shí)，通過(guò)加入一段分別與連接在抗體上的DNA互補(bǔ)的連接寡聚脫氧核苷酸，PLA探針上的DNA就會(huì)與該段DNA互補(bǔ)，然后在連接酶的作用下，形成一個(gè)閉環(huán)。然后再加入含有熒光標(biāo)記的核苷酸和聚合酶的擴(kuò)增緩沖液，通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）最終可以在相互作用位點(diǎn)形成數(shù)百個(gè)密集的DNA環(huán)，而高濃度的熒光信號(hào)在熒光顯微鏡下顯示為一個(gè)明亮的斑點(diǎn)，易于檢出[7]。在本研究中，我們將In Situ PLA技術(shù)應(yīng)用于原位驗(yàn)證MTA1與NuRD復(fù)合體其他組分的相互作用，并進(jìn)一步實(shí)施亞細(xì)胞定位分析。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

HCT116細(xì)胞為ATCC來(lái)源，培養(yǎng)條件為DMEM+10%胎牛血清，5%CO2。

圖1 體外IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)MTA1與HDAC2、Mi2、MBD3的相互作用

1.2 抗體與Duo-link試劑盒

鼠源MTA1一抗購(gòu)買(mǎi)于Abcam公司；兔源Mi2和MBD3一抗購(gòu)買(mǎi)于SANTA Cruze；兔源HDAC2一抗購(gòu)買(mǎi)于Bioworld公司；Duo-link試劑盒購(gòu)買(mǎi)于Olink Bioscience公司。

1.3 體外co-IP實(shí)驗(yàn)

圖2 原位顯示MTA1與Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用

實(shí)驗(yàn)步驟：①收集10 cm大皿的細(xì)胞，NP-40裂解液裂解，提取蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量；②取500μg總蛋白，加入2μg的MTA1一抗，于4℃搖床孵育過(guò)夜；③加入20μl proteinA/G beads（Santa Cruze），4℃搖床 2 h；④離心收集beads，NP-40裂解液洗滌6次；⑤使用25 μl蛋白上樣緩沖液煮沸10 min，離心收集上清液；⑥采用Western Blot法鑒定捕獲的蛋白。

1.4 In Situ PLA實(shí)驗(yàn)

按照Duo-link試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，大致步驟為：①制備HCT116細(xì)胞爬片；②將爬片固定于載玻片上，經(jīng)多聚甲醛固定，Triton-X打孔，BSA封閉后加入鼠源MTA1一抗及另一種待測(cè)蛋白的兔源一抗，4℃孵育過(guò)夜；③加入試劑盒中帶標(biāo)記探針的二抗Mouse-PLUS和Rabbit-MINUS，于37℃下孵育1 h；④加入連接反應(yīng)液，于37℃下反應(yīng)30 min；⑤加入擴(kuò)增反應(yīng)液，于37℃下反應(yīng)100 min；⑥封片，熒光顯微鏡下檢測(cè)紅色斑點(diǎn)狀陽(yáng)性信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 IP 技術(shù)證明HCT116 細(xì)胞中MTA1 與HDAC2、Mi2、MBD3的相互作用

研究報(bào)道MTA1是NuRD復(fù)合體的一個(gè)重要組分[3]，在前期IP-質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)利用MTA1抗體可以捕獲所有已知的NuRD組分，并且通過(guò)體外co-IP技術(shù)，我們證實(shí)HCT116細(xì)胞裂解液中MTA1與NuRD組分-HDAC2、Mi2、MBD3具有明顯的相互作用（圖1）。

2.2 In Situ PLA 技術(shù)原位顯示MTA1 與HDAC2、Mi2、MBD3在胞內(nèi)的相互作用

體外實(shí)驗(yàn)無(wú)法完全模擬復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，因此接下來(lái)我們首次利用In Situ PLA技術(shù)對(duì)MTA1與NuRD復(fù)合體其他組分HDAC2、Mi2、MBD3的相互作用進(jìn)行了體內(nèi)原位檢測(cè)。如圖2所示，紅色點(diǎn)狀顆粒即表示兩種蛋白具有相互作用，為相互作用陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)果表明MTA1與Mi2、HDAC2、MBD3均具有明顯的胞內(nèi)相互作用。因?yàn)殛?yáng)性信號(hào)數(shù)量的多少可以間接反映相互作用能力強(qiáng)弱，因此我們進(jìn)一步對(duì)50個(gè)細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，結(jié)果表明MTA1-HDAC2組陽(yáng)性信號(hào)數(shù)最多，為363個(gè)；MTA1-Mi2組次之，為280個(gè)；而MTA1-MBD3組最少，為208個(gè)，表明這三者中MTA1-HDAC2相互作用能力最強(qiáng)，MTA1-Mi2次之，MTA1-MBD3最弱。以MTA1-IgG為陰性對(duì)照，分別原位檢測(cè)MTA1與Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用，圖中紅色斑點(diǎn)顆粒即表示一個(gè)相互作用反應(yīng)。箭頭指示該相互作用位于胞質(zhì)

2.3 MTA1/NuRD復(fù)合體在間期細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析

最初文獻(xiàn)報(bào)道MTA1是一個(gè)核定位蛋白，因此之前研究均將MTA1/NuRD視為一個(gè)核定位的轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體進(jìn)行功能探索。但是最近大量文獻(xiàn)提示MTA1也分布于胞質(zhì)中，并有可能在胞質(zhì)中發(fā)揮重要功能[8]，因此我們進(jìn)一步對(duì)MTA1/NuRD復(fù)合體進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果表明在Mi2、HDAC2及MBD3三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中分別有25.0%、22.1%及27.0%的胞質(zhì)定位信號(hào)，表明MTA1/NuRD復(fù)合體在胞質(zhì)中也有分布，其比例約占總數(shù)的 1/4（圖 3）。

圖3 對(duì)間期細(xì)胞中MTA1與Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用信號(hào)進(jìn)行定量分析

2.4 MTA1/NuRD 復(fù)合體在M 期細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)分布，我們進(jìn)一步對(duì)MTA1/NuRD復(fù)合體在有絲分裂期（M期）細(xì)胞中的分布進(jìn)行了定位研究。結(jié)果我們首次發(fā)現(xiàn)，雖然在間期MTA1-Mi2主要作用于胞核，但是進(jìn)入M期后，幾乎全部的陽(yáng)性信號(hào)均分布于凝集的染色體外周（圖4）。MTA1-HDAC2及MTA1-Mi2相互作用的原位分析均得出一致的結(jié)果。該結(jié)果不僅進(jìn)一步證實(shí)MTA1/NuRD復(fù)合體的確存在胞質(zhì)分布，也提示MTA1/NuRD復(fù)合體可能參與了細(xì)胞周期調(diào)控。通過(guò)檢測(cè)MTA1-Mi2在HCT116細(xì)胞中的相互作用，原位顯示MTA1/NuRD復(fù)合體在有絲分裂期的亞細(xì)胞定位。圖中紅色斑點(diǎn)顆粒即表示一個(gè)相互作用反應(yīng)。

圖4 MTA1/NuRD復(fù)合體在M期細(xì)胞中的分布

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MTA1在腫瘤發(fā)生發(fā)展尤其是侵襲遷移過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。目前MTA1的功能研究主要集中于胞核轉(zhuǎn)錄因子。然而最近有多篇文章報(bào)道MTA1存在胞質(zhì)定位，并且有文章研究指出MTA1在胞質(zhì)中可能參與內(nèi)吞過(guò)程[8]。

NuRD復(fù)合體是目前發(fā)現(xiàn)的MTA1促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的最主要作用機(jī)制。但是關(guān)于MTA1與NuRD復(fù)合體的相互作用現(xiàn)在只有體外的IP-質(zhì)譜證據(jù)，研究者同時(shí)指出NuRD復(fù)合體中的約70 kD的蛋白有可能是一個(gè)與MTA1非常相近的蛋白。在本實(shí)驗(yàn)，我們首次通過(guò)In Situ PLA實(shí)驗(yàn)對(duì)MTA1與NuRD復(fù)合體其他組分之間的相互作用進(jìn)行了體內(nèi)原位分析，從體內(nèi)水平進(jìn)一步驗(yàn)證了MTA1是NuRD復(fù)合體的一個(gè)組分。

Mi2、HDAC2、MBD3是NuRD復(fù)合體中的關(guān)鍵因子，其均與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控有關(guān)。通過(guò)陽(yáng)性信號(hào)數(shù)量分析，我們判斷在NuRD復(fù)合體中，MTA1與HDAC2的相互作用能力最強(qiáng)，Mi2次之，而MBD3最弱。由于In Situ PLA實(shí)驗(yàn)的作用基礎(chǔ)是兩個(gè)蛋白分子有足夠近的距離，因而該結(jié)果說(shuō)明在NuRD復(fù)合體中MTA1可能與HDAC2的距離更近，從而有更多的機(jī)會(huì)發(fā)生寡核苷酸鏈的連接反應(yīng)，產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)。

雖然一直以來(lái)MTA1/NuRD復(fù)合體一直被當(dāng)作一個(gè)核轉(zhuǎn)錄抑制因子，但是至今沒(méi)有確鑿的證據(jù)表明MTA1/NuRD復(fù)合體只存在于胞核。由于已經(jīng)有多篇文章報(bào)道MTA1存在胞質(zhì)定位，提示我們MTA1/NuRD復(fù)合體可能也存在胞質(zhì)定位。In Situ PLA技術(shù)的一個(gè)最大的優(yōu)勢(shì)就在于可以準(zhǔn)確顯示兩個(gè)蛋白之間的作用位點(diǎn)。而通過(guò)該技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)，MTA1/NuRD復(fù)合體不僅僅存在于胞核，在胞質(zhì)中也有明顯分布，胞質(zhì)中的分布量約占整個(gè)細(xì)胞總量的1/4。該結(jié)果進(jìn)一步表明，MTA1有可能既可以通過(guò)NuRD復(fù)合體在胞核中參與抑制腫瘤抑癌基因的表達(dá)，也可以通過(guò)NuRD復(fù)合體參與胞質(zhì)內(nèi)生物學(xué)功能的調(diào)控，如胞質(zhì)蛋白的去乙?；取?/p>

另外，雖然MTA1/NuRD復(fù)合體在間期主要存在于胞核（3/4），但是借助于In Situ PLA技術(shù)的原位指示優(yōu)勢(shì)，我們還首次發(fā)現(xiàn)MTA1/NuRD復(fù)合體在M期幾乎全部存在于染色體周?chē)?，表明在M期MTA1/NuRD復(fù)合體已經(jīng)與染色質(zhì)解離，無(wú)法參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但是很可能通過(guò)其胞質(zhì)定位參與細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)控。

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