尹龍燕，李莉平，楊 靜，耿 寬，延 根

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510180；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院影像科，廣東 汕頭 515041）

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的中病死率一直居高不下。有研究［1-2］表明卵巢癌的5 年生存率約為45%，晚期患者的生存率僅為30%，這是因?yàn)槁殉舶┑陌l(fā)病機(jī)制尚不明確，并且進(jìn)展較為隱匿，部分患者確診時(shí)已是處于晚期，并往往對(duì)化療耐藥。因此，更好地理解卵巢癌的生物機(jī)制和預(yù)后是必要的，有助于開發(fā)更有效的治療方法。在這種背景下，應(yīng)用核Ki-67 來反映細(xì)胞的增殖活性具有極高的價(jià)值［3-6］。有研究［4］表明，Ki-67 高表達(dá)與多數(shù)腫瘤的分化相應(yīng)程度、是否浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移以及判斷預(yù)后情況密切相關(guān)。失活的擴(kuò)散標(biāo)記PKi-67 可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，特別是在增殖細(xì)胞中［4］。本研究探討腫瘤分布及其危險(xiǎn)因素、細(xì)胞增殖活性指標(biāo)Ki-67 在不同病理類型卵巢癌中的病理意義、Ki-67 表達(dá)與卵巢癌侵潤(rùn)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2006—2012 年廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院診斷為卵巢癌（病程=5 年）的156 例患者，術(shù)前經(jīng)超聲、多普勒血流頻譜檢測(cè)、病理切片檢查，符合WHO 關(guān)于卵巢癌的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，均采取手術(shù)治療，年齡為12～82 歲，平均（52.52±14.13）歲。按病理FIGO（2000 年）分期法分類:漿液性腫瘤（漿液性乳頭狀癌）81 例，黏液性腫瘤（黏液性乳頭狀癌）26 例，子宮內(nèi)膜樣癌16 例，透明細(xì)胞癌8 例，惡性畸胎瘤5 例，顆粒細(xì)胞瘤12 例，未分化癌3例，無性細(xì)胞瘤5 例。

1.2 主要試劑與儀器

Ki-67 抗體即用型，克隆號(hào)為K-2（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。DAB 顯色試劑盒和Maxvision 即用型二抗（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。Phy-3 型病理組織烘漂儀（常州鐘偉電子儀器廠）。OlympusBX40 顯微照相鏡（日本Olympus 公司）。

1.3 Ki-67 的免疫組織化學(xué)檢測(cè)

標(biāo)本采用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋以及切片。免疫組織化學(xué)染色首先經(jīng)高溫高壓抗原修復(fù)，冷卻至室溫后，倒掉緩沖液，清水中沖洗2 次，每次5 min，再用PBS 沖洗2 次，每次5 min。將組織周圍PBS 液擦拭干凈，采用BSA 封閉液封閉，在37 ℃恒溫箱中進(jìn)行30 min 的血清封閉過程。一抗室溫2 h，二抗室溫20 min，而后加入A、B、C 試劑各1 滴，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間及DAB 顯色過程，經(jīng)顯色確認(rèn)后蘇木精輕度復(fù)染。脫水、透明、中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.4 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組織化學(xué)陽性染色呈細(xì)胞核內(nèi)棕黃色顆粒，根據(jù)染色程度和染色陽性細(xì)胞百分比來進(jìn)行評(píng)分。Olympus 光學(xué)顯微鏡下觀察，每份切片隨機(jī)挑選5 個(gè)高倍視野（×400），按照如下判斷標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)(基本不著色)，陽性細(xì)胞數(shù)約為0%～5%；Ⅰ級(jí)，陽性細(xì)胞數(shù)為6%～25%或胞漿或胞核內(nèi)稀疏的棕色顆粒，就是棕褐色不明顯；Ⅱ級(jí)，陽性細(xì)胞數(shù)為26%～50%，出現(xiàn)較多的棕黃色顆粒；Ⅲ級(jí)，陽性細(xì)胞數(shù)＞50%，顯示彌漫粗大的棕褐色顆粒。

1.5 隨訪

前5 年每3～6 個(gè)月進(jìn)行隨訪1 次，之后每年1次。隨訪方式主要包括：電話詢問、信訪、門診復(fù)查。主要進(jìn)行婦科雙合診及超聲檢查，全血細(xì)胞計(jì)數(shù)和生化檢查。如檢查中CA125 水平升高伴超聲檢查中發(fā)現(xiàn)異常時(shí)做相應(yīng)的臨床處置。隨訪時(shí)間為3～60個(gè)月。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，2 組間參數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)；率的比較用卡方檢驗(yàn)、Fisher 精確檢驗(yàn)；以是否發(fā)生轉(zhuǎn)移或者局部浸潤(rùn)為因變量，以患者的一般情況和臨床情況為應(yīng)變量，使用Logistic 回歸統(tǒng)計(jì)進(jìn)行多因素分析；以患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或者死亡作為結(jié)局事件，采用逐步回歸法進(jìn)行Cox 模型分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤分布及危險(xiǎn)因素分析

左側(cè)腫瘤47 例 占30.1%，右側(cè)腫瘤78 例占50.0%，雙側(cè)腫瘤31 例占19.9%；局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移84 例，占59.6%；多部位轉(zhuǎn)移或者浸潤(rùn)多個(gè)器官36例，占25.5%；臨近腸壁浸潤(rùn)42 例，占29.8%；大網(wǎng)膜浸潤(rùn)62 例，占44.0%；轉(zhuǎn)移到肝臟、肺部或者遠(yuǎn)處淋巴結(jié)7 例，占5.0%。以患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或者死亡作為結(jié)局事件，采用逐步回歸法進(jìn)行Cox 模型分析，發(fā)現(xiàn)化療次數(shù)和孕次是保護(hù)因素，而局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和盆腔浸潤(rùn)是危險(xiǎn)因素，見表1。

表1 卵巢癌Cox 模型篩選的危險(xiǎn)因素及參數(shù)估計(jì)

2.2 有無浸潤(rùn)及不同病理組織分類中Ki-67 表達(dá)比較

156 例患者中85 例患者進(jìn)行Ki-67 的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。Ki-67 表達(dá)呈陰性（0 級(jí)）18 例：上皮性腫瘤11 例，生殖性腫瘤7 例；未見遠(yuǎn)處組織或周邊組織的浸潤(rùn)11 例，有浸潤(rùn)7 例。Ki-67 表達(dá)呈弱陽性（Ⅰ級(jí)）21 例：上皮性腫瘤20 例，生殖性腫瘤1例；未見遠(yuǎn)處組織或周邊組織的浸潤(rùn)8 例，有浸潤(rùn)13 例。Ki-67 表達(dá)呈強(qiáng)陽性（Ⅱ級(jí)）20 例：上皮性腫瘤19 例，生殖性腫瘤1 例；未見遠(yuǎn)處組織或周邊組織的浸潤(rùn)2 例，有浸潤(rùn)18 例。Ki-67 表達(dá)呈強(qiáng)陽性（Ⅲ級(jí)）26 例：上皮性腫瘤24 例，生殖性腫瘤2 例；未見遠(yuǎn)處組織或周邊組織的浸潤(rùn)6 例，有浸潤(rùn)20例。有無浸潤(rùn)之間Ki-67 表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)意義（有浸潤(rùn)的腫瘤組織Ki67 陽性程度比較高，P＜0.01）；不同病理組織分類之間Ki-67 表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）。見表2—4。

表2 156 例患者Ki-67 檢測(cè)情況 %

表3 有無浸潤(rùn)患者Ki-67 等級(jí) 例

表4 不同病理組織類別Ki-67 等級(jí) 例

3 討論

對(duì)卵巢癌患者全面確定病理組織類型及病理分期探查術(shù)是近年來提出的新手術(shù)觀念，目的是對(duì)惡性卵巢癌準(zhǔn)確分期，以指導(dǎo)治療方案。NCCN 指南（2011 年版）［7］指出需要行手術(shù)治療的患者，不管是根治性手術(shù)還是保守手術(shù)，都應(yīng)該仔細(xì)、全面、認(rèn)真地分期，這樣可以更全面地評(píng)價(jià)腫瘤，從而有可能降低術(shù)后復(fù)發(fā)率。Ki-67 是細(xì)胞核內(nèi)一種蛋白抗原，主要參與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)過程，分子質(zhì)量為345 ku和395 ku，其相關(guān)基因編碼的位置處于第10 號(hào)染色體上[8］。Ki-67 出現(xiàn)于細(xì)胞有絲分裂期的G1 中期到晚期，隨著有絲分裂的進(jìn)行，再S 期和G2 期逐漸達(dá)到峰值，分裂結(jié)束后，將抗原決定簇迅速降解或丟失，在G0 期時(shí)則不表達(dá)，半衰期為l h 或更短。目前研究［4，9-11］已經(jīng)表明，Ki-67與相關(guān)腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有著密切關(guān)系，近年來在臨床或者腫瘤研究中得到廣泛應(yīng)用，被認(rèn)為是反映細(xì)胞增殖活性的理想指標(biāo)。Ki-67 的高表達(dá)被認(rèn)為與多數(shù)腫瘤的相關(guān)分化程度、是否浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后情況有關(guān)[4，12-13］；Ki-67 在卵巢良性、交界性、惡性上皮性腫瘤中，其表達(dá)水平依次提高，尤其是惡性組的表達(dá)水平顯著高于良性組及交界組[14-16］。本研究結(jié)果顯示：有無侵潤(rùn)及不同病理組織分類中Ki-67 表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。Ki-67 作為一種判斷細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，對(duì)于判斷卵巢癌發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后判斷都是極有意義的，并可以間接指導(dǎo)治療方案。

惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的途徑與方式主要是血行轉(zhuǎn)移和種植性轉(zhuǎn)移。卵巢癌易發(fā)生種植播散，腫瘤多穿透盆腔形成腹膜種植，脫落的種植細(xì)胞可隨腹水種植到膈下。淋巴轉(zhuǎn)移主要累及髂內(nèi)、外淋巴結(jié)，主動(dòng)脈旁及主動(dòng)脈前淋巴結(jié)。腹膜種植轉(zhuǎn)移可分成兩種：浸潤(rùn)性種植與非浸潤(rùn)性種植。其中浸潤(rùn)性種植較為典型，特點(diǎn)為上皮組織增生不規(guī)則，并浸潤(rùn)?quán)徑蛳路降恼＝M織。對(duì)于浸潤(rùn)性與非浸潤(rùn)性種植的診斷標(biāo)準(zhǔn)，目前尚有爭(zhēng)議。Bell 等[17］提出的對(duì)浸潤(rùn)性種植的診斷標(biāo)準(zhǔn)是：上皮不規(guī)則增生，浸潤(rùn)腹膜鄰近或下方的正常組織，并且另外提出了2 個(gè)診斷浸潤(rùn)性種植的額外附加標(biāo)準(zhǔn)：1)微乳頭結(jié)構(gòu)；2)實(shí)性上皮巢或乳頭被空隙包圍。NCCN 指南（2011 年版）針對(duì)卵巢腫瘤化療一線方案仍建議采用包括腹腔化療和紫杉醇化療在內(nèi)的4 種方案。Bell 等［18］認(rèn)為有以下危險(xiǎn)因素：1)年齡＞55 歲；2)腫瘤包膜不完整、腫瘤破裂；3)腹水及廣泛粘連；4)組織學(xué)為非漿液性者；5)DNA 指數(shù)為非整倍體；6) CA125、血清基質(zhì)金屬蛋白酶2(MP-2)明顯增加，尿微量白蛋白(UMA)及CEA 強(qiáng)陽性表達(dá)者及處于進(jìn)展期者，應(yīng)在術(shù)后行輔助化療。在本研究中，筆者利用逐步回歸法對(duì)Cox 模型進(jìn)行分析，探討化療次數(shù)和孕次、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和盆腔浸潤(rùn)等多因素作用下預(yù)后及生存率的關(guān)系。結(jié)果示化療次數(shù)和孕次是保護(hù)因素，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和盆腔浸潤(rùn)是高危因素。因此，臨床工作中應(yīng)注重這些危險(xiǎn)因素的處理與化療結(jié)合的密切關(guān)系。

Ki-67 的表達(dá)與卵巢癌病理分期密切相關(guān)，對(duì)臨床治療提供了一個(gè)全面、客觀的信息。由于卵巢癌預(yù)后多發(fā)危險(xiǎn)因素，應(yīng)對(duì)患者進(jìn)行密切隨訪。在對(duì)卵巢癌患者的診斷及治療時(shí)應(yīng)全面觀察及評(píng)價(jià)，對(duì)有高危因素者及有條件化療者應(yīng)給予化療。

［1］Burger R A，Brady M F，Bookman M A，et al.Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer［J］.N Engl J Med，2011，365(26):2473-2483.

［2］Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.The impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(4):212-236.

［3］Aune G，Stunes A K，Tingulstad S，et al.The proliferation markers Ki-67/MIB-1，phosphohistone H3，and survivin may contribute in the identification of aggressive ovarian carcinomas［J］.Int J Clin Exp Pathol，2011，4(5):444-453.

［4］Rahmanzadeh R，Rai P，Celli J P，et al.Ki-67 as a molecular target for therapy in an in vitro three-dimensional model for ovarian cancer ［J］.Cancer Res，2010，70 (22):9234-9242.

［5］Kuhn E，Kurman R J，Sehdev A S，et al.Ki-67 labeling index as an adjunct in the diagnosis of serous tubal intraepithelial carcinoma［J］.Int J Gynecol Pathol，2012，31(5):416-422.

［6］Li W，Cai J H，Zhang J，et al.Effects of cyclooxygenase inhibitors in combination with taxol on expression of cyclin d1 and ki-67 in a xenograft model of ovarian carcinoma［J］.Int J Mol Sci，2012，13(8):9741-9753.

［7］Schnipper L E，Smith T J，Raghavan D，et al.American society of clinical oncology identifies five key opportunities to improve care and reduce costs:the top five list for oncology［J］.J Clin Oncol，2012，30(14):1715-1724.

［8］Chalkidou A，Landau D B，Odell E W，et al.Correlation between Ki -67 immunohistochemistry and 18F -fluorothymidine uptake in patients with cancer:A systematic review and meta-analysis［J］.Eur J Cancer，2012，48(18):3499-3513.

［9］Keam B，Im S A，Lee K H，et al.Ki-67 can be used for further classification of triple negative breast cancer into two subtypes with different response and prognosis［J］.Breast Cancer Res，2011，13(2):R22.

［10］Fasanella S，Leonardi E，Cantaloni C，et al.Proliferative activity in human breast cancer:Ki-67 automated evaluation and the influence of different Ki-67 equivalent antibodies［J］.Diagn Pathol，2011，6(S 1):S7.

［11］Aune G，Stunes A K，Tingulstad S，et al.The proliferation markers Ki-67/MIB-1，phosphohistone H3，and survivin may contribute in the identification of aggressive ovarian carcinomas［J］.Int J Clin Exp Pathol，2011，4(5):444-453.

［12］Rattan R，Graham R P，Maguire J L，et al.Metformin suppresses ovarian cancer growth and metastasis with enhancement of cisplatin cytotoxicity in vivo［J］.Neoplasia，2011，13(5):483-491.

［13］Mitra A K，Sawada K，Tiwari P，et al.Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis ［J］.Oncogene，2011，30(13):1566-1576.

［14］Nieman K M，Kenny H A，Penicka C V，et al.Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth［J］.Nat Med，2011，17(11):1498-1503.

［15］Vaughan S，Coward J I，Bast R C，et al.Rethinking ovarian cancer:recommendations for improving outcomes［J］.Nat Rev Cancer，2011，11(10):719-725.

［16］Zillhardt M，Park S M，Romero I L，et al.Foretinib (GSK 1363089)，an orally available multikinase inhibitor of c-Met and VEGFR-2，blocks proliferation，induces anoikis，and impairs ovarian cancer metastasis ［J］.Clin Cancer Res，2011，17(12):4042-4051.

［17］Bell K A，Smith Sehdev A E，Kurman R J.Refined diagnostic criteria for implants associated with ovarian atypical proliferative serous tumors(borderline) and micropapillary serous carcinomas ［J］.Am J Surg Pathol，2001，25(4):419-432.

［18］Bell D A，Scully R E.Ovarian serous borderline tumors with stromal microinvasion:a report of 21 cases［J］.Hum Pathol，1990，21(4):397-403.