許文花，文亦芾，馬向麗，羅富成，任 健

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201））

植物生長(zhǎng)過程，要經(jīng)受低溫、鹽害、干旱等各種不利環(huán)境造成的逆境脅迫，逆境的影響廣泛涉及各種植物生理和生化過程，嚴(yán)重時(shí)影響植物的正常生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致死亡［1，2］。研究植物對(duì)逆境脅迫的生理反應(yīng)，不僅是認(rèn)識(shí)植物與環(huán)境關(guān)系的一條重要途徑，有助于揭示植物適應(yīng)逆境的生理機(jī)制，而且也為生產(chǎn)中保護(hù)植物免受逆境傷害，提高其抗逆性，創(chuàng)造有利于植物生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境條件提供理論基礎(chǔ)［3］。

了解基因在逆境脅迫中的作用，是植物生理研究的重要領(lǐng)域。乙醛脫氫酶被認(rèn)為是與逆境有很大關(guān)系的一類酶類，它是生物體內(nèi)活性氧物質(zhì)清除過程中的重要酶類，它可以催化有毒的醛類氧化，形成對(duì)應(yīng)的無毒羧酸，維持生物機(jī)體中醛類物質(zhì)的微量平衡；乙醛脫氫酶能有效降低乙醛的濃度，促進(jìn)乙醇的消化代謝。因此，乙醛脫氫酶起著實(shí)質(zhì)性消化乙醇的作用，是乙醇消化代謝過程中的關(guān)鍵性酶，乙醛脫氫酶催化乙醛與乙酸之間的相互轉(zhuǎn)化過程，這些作用是在有關(guān)植物乙醇消化代謝過程中了解的較少的環(huán)節(jié)。

試驗(yàn)研究表明，在誘導(dǎo)條件下用熒光定量法（RT－PCR）數(shù)據(jù)表明羊草乙醛脫氫酶基因的表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)?？傮w分析表明，該基因?qū)}的影響要高于干旱和冷凍［4］。半定量RT－PCR研究齒肋赤蘚乙醛脫氫酶，結(jié)果表明在干旱脅迫狀態(tài)時(shí)的表達(dá)量顯著高于水合狀態(tài)，說明乙醛脫氫酶基因可能參與干旱脅迫應(yīng)答。為進(jìn)一步研究齒肋赤蘚乙醛脫氫酶基因的抗旱機(jī)理提供理論依據(jù)［5］。轉(zhuǎn)乙醛脫氫酶基因番茄的研究表明，植株對(duì)環(huán)境脅迫造成的傷害具有較強(qiáng)的抗性，即乙醛脫氫酶基因具有提高植物抗氧化脅迫的功能［6］。

苜蓿屬于比較耐逆境脅迫的植株，根系強(qiáng)大，入土很深，在不同的地區(qū)都適應(yīng)生長(zhǎng)，從逆境脅迫下苜蓿乙醛脫氫酶基因的表達(dá)調(diào)控方面深入研究，以期從分子水平揭示苜蓿植株的逆境生理。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地自然概況

試驗(yàn)地選擇昆明市北郊云南農(nóng)業(yè)大學(xué)的草學(xué)實(shí)習(xí)基地，地理位置為 N 25°01′，E 103°00′，海拔1 913m，年平均溫度14.7℃ 。年降水量900～1 100mm，年日照時(shí)數(shù)2 411.8h，pH 6.5。屬北亞熱帶高原季風(fēng)氣候，干濕分明，6～10月份為雨季，11月至次年5月底為旱季。

1.2 材料與儀器、試劑

1.2.1 試驗(yàn)材料 紫花苜蓿種子于2012年12月種植，試驗(yàn)用提取核酸的苜蓿幼苗采于次年4月。

1.2.2 試驗(yàn)儀器和試劑 PCR儀（AB公司Gene－Amp PCR system 9700）；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（AB公司7500Fast Real－Time PCR Systems）；GEL DOC 2000凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO－RAD公司）；低溫高速離心機(jī)（Legend Micro 21，美國(guó) Thermo公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（Fresco 21，美國(guó) Thermo公司）；Bio－Rad POWER Pac 1000 穩(wěn)壓電泳儀（美國(guó)BIO－RAD公司）。

植物總RNA提取試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，cDNA 合成試劑盒（TransScript One－Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）和熒光定量PCR試劑盒（TransStart Top Green qPCR SuperMix）均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，2×Master MixTaq酶、DNA MarkerⅠ均購(gòu)自北京天根生化科技（北京）有限公司，DEPC購(gòu)自TaKa－Ra公司，GoldViewTM核酸染料購(gòu)自北京賽百勝基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品，氯仿、無水乙醇等試劑全部為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 鹽、低溫、干旱的脅迫處理 選取生長(zhǎng)一致的苜蓿幼苗，洗凈根系上的泥土，設(shè)3個(gè)處理，3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取苜蓿幼苗10～20株，培養(yǎng)于500mmol／L NaCl溶液進(jìn)行鹽脅迫處理，在水溶液中放置于4℃冰箱為冷凍處理，于20%PEG溶液培養(yǎng)進(jìn)行干旱處理，處理0、4、8、12和24h取葉片，液氮速凍后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總RNA提取 取新鮮嫩葉約2 000mg，放入預(yù)冷的研體中，迅速加入液氮充分研磨，收集粉末于離心管中，加入 Trizol Reagent 1mL，4℃、12 000r／min離心5min，離心后吸取上清液于新的離心管中，加入等體積異丙醇，離心沉淀?xiàng)壣锨逡?，?5%乙醇洗滌沉淀，DNaseI酶解可能混雜的基因組DNA，然后用適量的DEPC處理過的水溶解RNA，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定RNA的濃度和純度。

1.3.3 cDNA的合成 按照北京全式金公司產(chǎn)品提供試劑盒使用說明合，反轉(zhuǎn)錄程序42℃30min，85℃5min，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 RT－PCR 反應(yīng) 參照苜蓿基因組（http：∥medicagohapmap.org）乙醛脫氫酶基因（GeneID：Medtr3g026140）mRNA序列和Actin基因（GeneID：Medtr 3g095530），結(jié)合Primer 5.0的設(shè)計(jì)和Oligo 6.0評(píng)價(jià)，并用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Primer－Blast工具確認(rèn)引物的特異性，用于苜蓿乙醛脫氫酶基因和Actin基因的熒光定量PCR擴(kuò)增。引物由上海生物工程有限公司合成。配制混合液體，混合后，取20μL于平行孔中。反應(yīng)程序：95℃30s；95℃3s，56℃30s：共45次循環(huán)；Dissociation：自動(dòng)添加反應(yīng)總體系：20μL。

1.3.5 Real time PCR 數(shù)據(jù)分析：采用比較 CT 法（△△CT），數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值。Spss 17.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿乙醛脫氫酶基因和β－actin基因的PCR擴(kuò)增

通過瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)到苜蓿乙醛脫氫酶基因和β－actin基因的PCR擴(kuò)增DNA的片段（圖1）。

圖1 苜蓿乙醛脫氫酶基因和β－actin基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of aldehyde dehydrogenase gene andβ－actin gene

2.2 乙醛脫氫酶基因在苜蓿不同組織部位的表達(dá)

取苜蓿的葉、莖、根通過上述測(cè)定方法，結(jié)果顯示在葉片部分的表達(dá)量為1.05，在莖的表達(dá)量為0.76，在根的表達(dá)量為0.03。研究中取葉片作為苜蓿乙醛脫氫酶表達(dá)量的測(cè)定是較理想的材料。

2.3 鹽脅迫處理下苜蓿葉片乙醛脫氫酶基因的表達(dá)變化

鹽脅迫處理下，苜蓿植株葉片的乙醛脫氫酶基因的表達(dá)量發(fā)生了變化（表1），與對(duì)照相比處理4h，葉片中乙醛脫氫酶含量下降，處理8h的含量也相對(duì)小于處理4h，而鹽脅迫處理12h的含量相對(duì)對(duì)照、處理4h、處理8h的含量升高。鹽脅迫處理24h的表達(dá)量相對(duì)下降，低于處理12h的含量。乙醛脫氫酶基因調(diào)控著機(jī)體內(nèi)部的變化，在不同處理時(shí)間下機(jī)體內(nèi)的乙醛脫氫酶發(fā)生著微妙的變化，不同處理間相差顯著，表明RT－PCR能夠檢測(cè)到苜蓿植株體內(nèi)的乙醛脫氫酶的微妙的變化，是對(duì)逆境產(chǎn)生這種變化的適應(yīng)的結(jié)果。表明苜蓿植株對(duì)鹽脅迫表現(xiàn)出明顯的適應(yīng)性，比較敏感。

表1 逆境脅迫下苜蓿乙醛脫氫酶基因相對(duì)表達(dá)量Table1 The expression of ALDH gene under the salt stress

2.4 低溫脅迫下苜蓿葉片乙醛脫氫酶基因的表達(dá)

低溫處理下，RT－PCR能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)到苜蓿葉片乙醛脫氫酶含量發(fā)生的變化（表1），不同處理間相差顯著。與對(duì)照相比低溫處理4h含量低于對(duì)照，低溫處理8h的苜蓿葉片乙醛脫氫酶含量高于處理4h的，低溫處理12h含量低于處理8h含量，低溫處理24h的含量低于低溫處理12h的含量。低溫條件下苜蓿乙醛脫氫酶對(duì)逆境表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性，表達(dá)量有升有降。

2.5 干旱脅迫下苜蓿葉片乙醛脫氫酶基因的表達(dá)

苜蓿在干旱脅迫處理下，乙醛脫氫酶的表達(dá)量很少，但RT－PCR能夠檢測(cè)到很少的變化，表明在逆境條件下能夠運(yùn)用RT－PCR技術(shù)直觀的檢測(cè)到其微妙變化。干旱脅迫處理4h時(shí)植株基本沒有表達(dá)，干旱處理8h植株乙醛脫氫酶含量的表達(dá)量高于4h低于對(duì)照，干旱處理12h時(shí)低于處理8h、對(duì)照。干旱處理24h苜蓿乙醛脫氫酶的表達(dá)量高于處理12h的低于對(duì)照。乙醛脫氫酶基因的表達(dá)量顯示苜蓿植株對(duì)干旱脅迫處理下表現(xiàn)出明顯的調(diào)節(jié)作用，乙醛脫氫酶基因的表達(dá)量顯示植株對(duì)干旱脅迫很敏感，不同處理間相差顯著，對(duì)逆境表現(xiàn)出很大的不適應(yīng)特征。

3 討論

在逆境脅迫下植株體內(nèi)發(fā)生很多的生理和生化反應(yīng)，是對(duì)外界環(huán)境的一種適應(yīng)性。在逆境脅迫下，苜蓿乙醛脫氫酶的表達(dá)量的變化能夠反應(yīng)出對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，其中，對(duì)鹽脅迫處理的適應(yīng)性高于低溫處理，高于干旱處理。干旱處理下植株乙醛脫氫酶的表達(dá)量的變化說明環(huán)境的調(diào)節(jié)機(jī)制較小，表達(dá)量很小。從生理角度講各種逆境條件如干旱、高鹽、低溫、水淹或重金屬等環(huán)境脅迫，都可以使活性氧物質(zhì)（ROS）在植物細(xì)胞中快速、大量的積累，從而造成氧化脅迫。氧化脅迫的危害一方面是活性氧物質(zhì)直接損傷蛋白質(zhì)、氨基酸和核酸，并導(dǎo)致膜脂的過氧化反應(yīng)［7，8］；另一方面是膜脂的過氧化反應(yīng)能產(chǎn)生一些如醛類、烴類、酮和羥酸類等高活性的、有毒的化學(xué)物質(zhì)，毒害細(xì)胞甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡［9－12］。醛是膜脂過氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物，是一種活性氧誘導(dǎo)的高毒性物質(zhì)，它對(duì)核酸、氨基酸和蛋白質(zhì)等會(huì)造成嚴(yán)重傷害［13］，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)的水解活性大于合成活性，氧化活性大于還原活性。試驗(yàn)中在各種逆境脅迫下植株葉片的乙醛脫氫酶基因表達(dá)量有升有降，表明逆境下植株的各種代謝活動(dòng)減弱，植株表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境極大的不適應(yīng)性。乙醛脫氫酶基因的表達(dá)在不同的處理?xiàng)l件下，有升高也有下降的，在處理的這段時(shí)間內(nèi)，植株生理機(jī)制發(fā)生著微妙的變化，尤其在鹽處理、低溫處理下植株表現(xiàn)出健壯生長(zhǎng)。而在干旱處理下植株表現(xiàn)葉片變薄、萎焉。乙醛脫氫酶基因的表達(dá)量很少和基本不表達(dá)，表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境的另一種適應(yīng)性。

4 結(jié)論

通過對(duì)苜蓿葉、莖、根的乙醛脫氫酶基因表達(dá)量的測(cè)定，結(jié)果表明，葉片的表達(dá)量較高，熒光定量PCR能夠檢測(cè)到逆境脅迫下的苜蓿植株的乙醛脫氫酶的基因表達(dá)量的微妙的變化。能夠把這種方法運(yùn)用到逆境生理方面；各種脅迫處理?xiàng)l件下苜蓿植株乙醛脫氫酶的表達(dá)量不同，在不同的處理時(shí)間下苜蓿葉片的乙醛脫氫酶基因的表達(dá)量不同。

［1］ Munns R.Genes and salt tolerance：Bringing them together［J］.New Phytologist，2005，167（3）：645－663.

［2］ 劉歡，趙桂琴.燕麥抗逆性研究進(jìn)展［J］.草原與草坪，2007（6）：63－68.

［3］ 張亞軍，王麗學(xué)，陳超，等.植物對(duì)逆境的響應(yīng)機(jī)制研究進(jìn)展［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23（9）：60－65.

［4］ 李新玲，吳姝菊，王全偉.羊草乙醛脫氫酶（ALDH）基因片段的克隆及表達(dá)分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（4）：187－193.

［5］ 楊紅蘭，張道遠(yuǎn)，劉燕，等齒肋赤蘚乙醛脫氫酶基因ALDH21的克隆與表達(dá)分析［J］基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（1）：24－30.

［6］ 張海玲，尚晨，李佶愷，等.乙醛脫氫酶（ALDH）基因轉(zhuǎn)化番茄的研究［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（13）：23－29.

［7］ Halliwell B，Gutteridge J M C.Protection Against Oxidants in Biological Systems：The Superoxide Theory of Oxygen Toxicity［J］.Oxford：Clarendon Press，1989（2）：86－123.

［8］ 劉建新，王鑫，李博萍.外源一氧化氮供體SNP對(duì)NaC1脅迫下黑麥草幼苗葉片抗壞血酸一谷胱甘肽循環(huán)的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（2）：82－88.

［9］ Allen R D.Dissection of oxidative stress tolerance using transgenic plants［J］.Plant Physiology，1995，107（1）：1049－1054.

［10］ Bartels D.Molecular mechanisms of desiccation tolerance in plants［M］∥Storey K B.Molecular Mechanisms of Metabolic Arrest：Life in Limbo.Oxford：BIOS Scientific Publishers Ltd，2001，8（2）：187－196.

［11］ Mittle R.Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance［J］.Trends in Plant Science，2002，7（3）：405－410.

［12］ Ramanjulu S，Bartels D.Drought－and desiccation－induced modulation of gene expression in plants［J］.Plant Cell and Environment，2002，25（4）：141－151.

［13］ Skibbe D S，Liu F，Wen T J，etal.Characterization of the aldehyde dehydrogenase gene families ofZeamaysandArabidopsistkaliana［J］.Plant Molecular Biology，2002，48（3）：751－764.